楊雪鷗　楊露茜　袁濤　余正文　張林

摘要：提取細(xì)葉鼠曲草（Gnaphalium japonicum Thunb）總黃酮，比較傳統(tǒng)水溶性提取與超聲提取總黃酮的工藝差異，并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化細(xì)葉鼠曲草總黃酮提取工藝。結(jié)果表明，超聲醇提效果較好，條件為超聲時(shí)間30 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度60 ℃、料液比1∶30（g/mL），提取總黃酮含量為2 mg/g。

關(guān)鍵詞：細(xì)葉鼠曲草（Gnaphalium japonicum Thunb）；總黃酮；超聲提?。徽辉囼?yàn)

中圖分類號(hào)：TQ461 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）04-0712-04

細(xì)葉鼠曲草（Gnaphalium japonicum Thunb）為菊科鼠曲草屬植物，鼠曲草屬植物全世界共有200多種，分布廣泛，資源蘊(yùn)藏量大。中國(guó)鼠曲草屬植物有20余種[1]，在民間有相當(dāng)長(zhǎng)的使用史，俗稱“面蒿”、“清明菜”，是具有濃郁民族資源特色的食品[2]；同時(shí)也是豐富的藥用資源，廣泛用于痛風(fēng)、炎癥、癰瘡腫毒、腸炎痢疾、活血止血等病癥[3-6]，細(xì)葉鼠曲草就是其中的一種。細(xì)葉鼠曲草主要分布在中國(guó)長(zhǎng)江以南的地區(qū)，貴州省江口、貴陽(yáng)、平塘、荔波、雷山均有分布，生長(zhǎng)在海拔780～1 200 m的山坡陽(yáng)處草地，全草入藥，性甘平，清熱利濕，解毒清腫，主治結(jié)膜炎、咽喉腫痛、尿道炎[7]；畬族同胞常用于治療肝炎疾病，療效顯著[8]。前人的研究表明，鼠曲草屬植物的主要化學(xué)成分為黃酮和二萜類[9-11]。尚未見細(xì)葉鼠曲草提取純化相關(guān)化學(xué)成分方面的研究報(bào)道。本研究首次通過(guò)篩選細(xì)葉鼠曲草總黃酮提取工藝，獲得提取優(yōu)化工藝條件，為今后進(jìn)一步分離純化細(xì)葉鼠曲草總黃酮獲得有效成分提供參考，也為該資源的深入開發(fā)利用創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與材料

721型紫外分光光度計(jì)（天津冠澤科技有限公司）；HB-10250型數(shù)控超聲儀（江蘇漢邦科技有限公司）；BS210S型電子天平（北京賽多利斯天平股份公司）；EYELA N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（倍捷科技有限公司）。

細(xì)葉鼠曲草采集于貴州省江口縣，經(jīng)貴州省農(nóng)業(yè)植物鑒定專家孟祥順鑒定為菊科植物細(xì)葉鼠曲草；蘆丁由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1）細(xì)葉鼠曲草的提前處理。取細(xì)葉鼠曲草樣品于60 ℃烘箱中干燥3 h，粉碎后移入干燥器中保存待用。

2）細(xì)葉鼠曲草總黃酮提取方法考察。細(xì)葉鼠曲草粉末→60%乙醇浸泡0.5 h→回流3次，合并濾液，回收乙醇→定容→供試液A。細(xì)葉鼠曲草粉末→60%乙醇浸泡0.5 h→超聲3次，合并濾液，回收乙醇→定容→供試液B。細(xì)葉鼠曲草粉末→蒸餾水浸泡0.5 h→回流3次，合并濾液→定容→供試液C。細(xì)葉鼠曲草粉末→蒸餾水浸泡0.5 h→超聲3次，合并濾液→定容→供試液D。

3）測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，按標(biāo)準(zhǔn)品的方法進(jìn)行顯色，在波長(zhǎng)為200～800 nm處對(duì)供試樣品溶液和對(duì)照品溶液掃描。供試品和對(duì)照品均在510 nm處有最大吸收峰，故確定510 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密移取蘆丁1 mg/mL對(duì)照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于5個(gè)10 mL的量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻并放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻并放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，加入60%乙醇至刻度，搖勻并放置15 min，以60%乙醇溶劑為空白對(duì)照，于510 nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算線性回歸方程為y=0.147x+0.086，R2=0.992（n=5），結(jié)果顯示蘆丁濃度在20～60 μg/mL時(shí)具有良好線性關(guān)系。

5）細(xì)葉鼠曲草總黃酮含量的檢測(cè)。取供試液用60%乙醇定容至100 mL，取1 mL按標(biāo)準(zhǔn)品方法顯色，測(cè)定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮含量，即總黃酮含量=提取物總黃酮質(zhì)量/細(xì)葉鼠曲草質(zhì)量。

6）單因素試驗(yàn)。選擇適宜的溶劑和提取方法，對(duì)影響細(xì)葉鼠曲草總黃酮提取的可能因素，包括超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和料液比4個(gè)因素進(jìn)行考察。在此過(guò)程中，以所得提取液的總黃酮含量作為考察指標(biāo)，考察單因素對(duì)細(xì)葉鼠曲草總黃酮提取工藝的影響。

7）正交試驗(yàn)。為全面考察影響因素，優(yōu)化黔細(xì)葉鼠曲草中總黃酮的工藝提取條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定超聲時(shí)間（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取溫度（C）、料液比（D）為考察因子，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，按L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1），以細(xì)葉鼠曲草總黃酮含量為考察指標(biāo)，確定最佳工藝條件。

8）驗(yàn)證試驗(yàn)。為進(jìn)一步驗(yàn)證最佳工藝的可靠性，以優(yōu)化工藝進(jìn)行細(xì)葉鼠曲草總黃酮提取試驗(yàn)，重復(fù)3次，測(cè)定獲取細(xì)葉鼠曲草總黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝優(yōu)選

分別稱取藥材2 g，加50倍量60%乙醇，浸泡0.5 h，進(jìn)行回流提取和超聲提取各3次，合并回收乙醇至無(wú)醇味，用60%乙醇定容于100 mL量瓶中，得供試液A和B。分別稱取藥材2 g，加50倍量蒸餾水，浸泡0.5 h，進(jìn)行回流提取和超聲提取各3次，合并回收乙醇至無(wú)醇味，用60%乙醇定容于100 mL量瓶中，得供試液C和D。結(jié)果顯示乙醇超聲提取優(yōu)于其他方法，故選擇乙醇超聲提取作為總黃酮提取的方法（表2）。

2.2 單因素水平的確定

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 分別準(zhǔn)確稱取2 g干燥的黔細(xì)葉鼠曲草粉末5份，分別加入50%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液各60 mL，在溫度70 ℃、100 W超聲波功率的條件下超聲30 min，抽濾，定溶到100 mL，每次取1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)品的方法進(jìn)行顯色測(cè)其吸光度（圖1）。由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)增加有利于提取含量的增高，但不是越高越好。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，細(xì)葉鼠曲草總黃酮含量得以提高。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，提取總黃酮含量達(dá)最大值，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取總黃酮含量增加不顯著。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于80%時(shí)提取總黃酮含量迅速降低，其原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)大于80%時(shí)，提取液雜質(zhì)增加，溶液顏色變深，干擾紫外檢測(cè)因素增加。因此，篩選乙醇體積分?jǐn)?shù)60%～80%的范圍作為進(jìn)一步優(yōu)化范圍。

2.2.2 料液比 分別準(zhǔn)確稱取2 g干燥的黔細(xì)葉鼠曲草粉5份，按1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL，下同）的料液比加入乙醇溶液，在70 ℃、100 W超聲功率的條件下超聲30 min，抽濾，定容到100 mL，每次取1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)品方法顯色，測(cè)定吸光度（圖2）。由圖2可知，適當(dāng)增加溶劑有利于細(xì)葉鼠曲草總黃酮的溶出，當(dāng)料液比達(dá)到1∶30時(shí)，提取細(xì)葉鼠曲草總黃酮效果最好；然而繼續(xù)增加溶劑用量，提取總黃酮含量有所下降，究其原因可能與雜質(zhì)含量隨溶劑量增加而增大有關(guān)，并且溶劑量的增大勢(shì)必增大工藝提取成本，造成浪費(fèi)。因此綜合考慮各方面因素，選擇料液比1∶20～1∶40作為進(jìn)一步優(yōu)化的范圍。

2.2.3 超聲時(shí)間 準(zhǔn)確稱取2 g干燥的鼠曲草粉5份，分別加入60 mL 60%乙醇，在70 ℃、100 W超聲波功率的條件下分別提取20、30、40、50、60 min，抽濾，定容，按標(biāo)準(zhǔn)品顯色方法測(cè)定吸光度（圖3）。由圖3可知，超聲時(shí)間控制在30 min左右，所提細(xì)葉鼠曲草總黃酮含量達(dá)到最大，當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)30 min，提取總黃酮含量有所下降。因此篩選超聲時(shí)間20～40 min作為進(jìn)一步優(yōu)化的范圍。

2.2.4 提取溫度 分別準(zhǔn)確稱取2 g干燥的鼠曲草粉5份，分別加入60 mL 60%乙醇，在70 ℃、100 W的超聲條件下分別于30、40、50、60、70 ℃超聲30 min，抽濾，定容到100 mL，每次取1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)品顯色方法測(cè)定吸光度（圖4）。由圖4可知，適當(dāng)提高提取細(xì)葉鼠曲草的溫度，有利于總黃酮的溶出。溫度的增加，有利于溶劑分子的熱運(yùn)動(dòng)，增加滲透擴(kuò)散溶出的速度，提高了總黃酮的濃度，且溫度控制在70 ℃時(shí)提取效果最好，當(dāng)溫度進(jìn)一步提升，將增加細(xì)葉鼠曲草其他雜質(zhì)的溶出，降低總黃酮含量。因此，選擇提取溫度60～80 ℃作為進(jìn)一步優(yōu)化的范圍。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析

為綜合考察細(xì)葉鼠曲草總黃酮提取工藝影響因素的交叉效果，根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果及參考相關(guān)資料，確定以超聲時(shí)間（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取溫度（C）和料液比（D）4個(gè)考察因素考察藥材總黃酮含量，采用L9（34）正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)。由表3、表4可知，各因素對(duì)細(xì)葉鼠曲草總黃酮提取影響的順序?yàn)镃>A>B>D，即提取溫度>超聲時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比。并且提取溫度對(duì)提取細(xì)葉鼠曲草總黃酮有顯著影響，其他3個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響不顯著。因此，通過(guò)比較試驗(yàn)結(jié)果，篩選出的最優(yōu)試驗(yàn)條件為超聲時(shí)間30 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度60 ℃、料液比1∶30。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱取細(xì)葉鼠曲草2 g，共3份，按最佳工藝提取，藥液過(guò)濾，濃縮，定容于100 mL量瓶中。精密量取提取液1 mL定容于10 mL量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)品顯色方法測(cè)定吸光度，按照結(jié)果顯示最佳工藝提取3組藥液，所得細(xì)葉鼠曲草總黃酮吸光度為0.542、0.481、0.530，平均含量2 mg/g，試驗(yàn)結(jié)果高于正交試驗(yàn)其他組合，所得試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可行。

3 小結(jié)與討論

細(xì)葉鼠曲草作為一種貴州省民間藥食兩用的植物流傳甚廣，主要成分為黃酮和二萜類，然而目前深入研究開發(fā)的報(bào)道不多，僅局限于生藥學(xué)、理化性質(zhì)鑒定等方面[7]。本試驗(yàn)開創(chuàng)性地對(duì)細(xì)葉鼠曲草總黃酮提取工藝進(jìn)行了研究，取得了一定的成果。通過(guò)正交試驗(yàn)，得到細(xì)葉鼠曲草在提取時(shí)間30 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度60 ℃、料液比1∶30時(shí)提取效果最好，所得總黃酮含量為2 mg/g。另外，繼續(xù)篩選其他方法提取細(xì)葉鼠曲草總黃酮，不失為提高提取條件的優(yōu)良策略。比如微波提取法、堿性（酸性）稀醇提取法、酶法提取、熱壓流體萃取、超臨界流體萃取等。

參考文獻(xiàn)：

[1] 祁承經(jīng)，喻勛林.湖南種子植物總覽[M].長(zhǎng)沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

[2] 張慧穎，孫 赟，饒高雄.鼠曲草屬藥用植物化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2012，8（15）：60-63.

[3] LIN W Q，XIE J X，WU X M. Inhibition of xanthine oxidase activity by Gnaphalium affine extract[J].Chinese Medical Science，2014，29（4）：225-230.

[4] HUANG D D，CHEN Y H，CHEN W S，et al. Anti-inflammatory effects of the extract of Gnaphalium affine D. Don in vivo and in vitro[J].Ethnopharmacology，2015，176：356-364.

[5] XI Z X，CHEN W S，WU Z J，et al.Anti-complementary activity of flavonoids from Gnaphalium affine D. Don[J].Food Chemistry，2012，130（1）：165-170.

[6] 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志（第四冊(cè)）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1988.

[7] 陳藝林，石 鑄.貴州植物志（第九卷）[M].成都：四川民族出版社，1989.

[8] 胡 恩，陳坤全，陳清容.治平畬族鄉(xiāng)畬族同胞常用于治療肝炎的中草藥簡(jiǎn)介[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，2006（3）：159-160.

[9] 江蘇省植物研究所.新華本草綱要（第三冊(cè)）[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1990.

[10] TAMARA L，MERAGELMAN，GLORIA L，et al. Ent-pimarane type diterpenes from Gnaphalium gaudichaudianum[J].Phytochemistry，2003，62：569-572.

[11] RUBEN T，JULIO P，JORGE R，et al.Diterpenes from Gnaphalium pellitum and Gnaphalium graveolens[J].Phytochemistry，1992，7（31）：2415-2418.