韓琳 張繼瑜 袁莉剛 李冰

摘要：對(duì)牛雙芽巴貝斯蟲（Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ）潛在藥物靶標(biāo)Rａｐ－１的基因進(jìn)行克隆與序列分析。以蘭州株牛雙芽巴貝斯蟲基因組為模板，經(jīng)ＰＣＲ擴(kuò)增獲得了ｒａｐ－１基因，將該基因克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ上，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，對(duì)目的基因進(jìn)行酶切鑒定及序列測定分析。結(jié)果表明，ｒａｐ－１基因長度為８４６ ｂｐ，同源性分析結(jié)果顯示，克隆序列與ＧｅｎＢａｎｋ收錄的巴西株牛雙芽巴貝斯蟲的核苷酸序列同源性為９９．７４％，說明蘭州株牛雙芽巴貝斯蟲的ｒａｐ－１與ＧｅｎＢａｎｋ公布的參考基因具有高度同源性，ｒａｐ－１基因具有很高的保守性。

關(guān)鍵詞：牛雙芽巴貝斯蟲（Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ）；ｒａｐ－１基因；克??；序列分析

中圖分類號(hào)：Ｓ８５２．７；Ｑ７８９文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）06－1251-03

Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｐ－１ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ

ＨＡＮ Ｌｉｎ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｊｉ－ｙｕ２，ＹＵＡＮ Ｌｉ－ｇａｎｇ１，ＬＩ Ｂｉｎｇ２

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｌａｎｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ａｎｉｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００５０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｒａｐ－１ ｇｅｎｅ， ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｌａｎｚｈｏｕ ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ， ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＰＣＲ， ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ Ｂ. ｂｉｇｅｍｉｎａ ｒａｐ－１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ８４６ ｂｐ． Ｔｈｅ ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｌｏｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｗａｓ ａｓ ｈｉｇｈ ａｓ ９９．７４％， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｒａｐ－１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ； ｒａｐ－１； ｃｌｏｎｅ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙsis

牛雙芽巴貝斯蟲（Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ）在分類學(xué)上屬梨形蟲目巴貝斯蟲科巴貝斯蟲屬，該類寄生蟲寄生于牛的紅細(xì)胞，引起牛的血液原蟲病——牛雙芽巴貝斯蟲病［１］。牛雙芽巴貝斯蟲病又稱紅尿熱，一年內(nèi)可暴發(fā)數(shù)次，臨床主要表現(xiàn)為紅細(xì)胞數(shù)量明顯減少、貧血、黃疸、可視黏膜出血和血紅蛋白尿等，可引起宿主死亡［２］，該病是世界公認(rèn)的危害養(yǎng)牛業(yè)的主要寄生蟲病之一。牛雙芽巴貝斯蟲入侵紅細(xì)胞的過程是感染發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，對(duì)紅細(xì)胞的入侵是由位于牛雙芽巴貝斯蟲細(xì)胞膜表面的頂體復(fù)合器以及棒狀體上的相關(guān)蛋白質(zhì)介導(dǎo)的［３］，位于棒狀體的蛋白質(zhì)家族被稱為Rａｐ－１（Ｒｈｏｐｔｒｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）［４－６］，研究該類蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性及其功能對(duì)以Rａｐ－１為靶標(biāo)的藥物篩選和牛雙芽巴貝斯蟲病的防治具有重要意義。目前國內(nèi)基本沒有針對(duì)Rａｐ－１的相關(guān)研究和報(bào)道。

試驗(yàn)對(duì)蘭州株牛雙芽巴貝斯蟲株的ｒａｐ－１基因進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增與序列測定，旨在分析比較該基因在不同蟲株中的差異，為該基因的表達(dá)和生物學(xué)功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１質(zhì)粒與菌株質(zhì)粒ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞ＪＭ１０９均購自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。

１．１．２主要試劑血液ＤＮＡ提取試劑盒、ＤＮＡ凝膠回收試劑盒、ＥｃｏＲ Ｉ限制性內(nèi)切酶、ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ、ＤＬ５０００ Ｍａｒｋｅｒ、ＩＰＴＧ等均為ＴａＫａＲａ公司產(chǎn)品；Ｘ－ｇａｌ購自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Ｏｍｅｇａ公司；Ｇｏｌｄｅｎ Ｅａｓｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ購自ＴＩＡＮＧＥＮ公司。

１．２方法

１．２．１ＰＣＲ模板的制備采集蘭州地區(qū)經(jīng)鏡檢和ＰＣＲ法確診為被牛雙芽巴貝斯蟲感染的陽性的血液，加入檸檬酸鈉抗凝劑。用血液ＤＮＡ提取試劑盒提取蘭州株牛雙芽巴貝斯蟲全基因組，操作方法參考試劑盒說明書。

１．２．２引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)ＧｅｎＢａｎｋ中巴西株牛雙芽巴貝斯蟲基因ｒａｐ－１序列（登錄號(hào)：Ｎｏ．ＡＦ０１４４８６．１）設(shè)計(jì)引物，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。上游引物：５′－ＴＡＣＧＣＡＴＡＧＣＡＧＴＡＣＣＴ

ＣＴＡＧＡ－３′；下游引物：５′－ＴＴＧＧＴＣＧＴＣＧＴＴＴＡＴＴＴＣ

ＧＡＡＣ－３′。

１．２．３目的基因的ＰＣＲ擴(kuò)增及電泳鑒定ＰＣＲ反應(yīng)體系：ＤＮＡ模板４ μＬ，上、下游引物各１．０ μＬ，Ｇｏｌｄｅｎ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．１６ μＬ，２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １２．５ μＬ，用滅菌水補(bǔ)充至２５ μＬ。ＰＣＲ反應(yīng)條件：９５ ℃預(yù)變性４ｍｉｎ；９４ ℃變性４５ ｓ，５５ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０個(gè)循環(huán)；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。用１％瓊脂糖凝膠電泳檢測ＰＣＲ產(chǎn)物。

１．２．４ＰＣＲ產(chǎn)物回收與純化ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳后，將目的條帶切下，參照ＰＣＲ產(chǎn)物純化回收試劑盒說明回收目的ＤＮＡ，于－２０ ℃保存。

１．２．５ｒａｐ－１基因的克隆連接體系：ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ １μＬ，ｒａｐ－１ ＰＣＲ純化回收產(chǎn)物３ μＬ，２×Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １ μＬ，共計(jì)１０ μＬ。在１６ ℃條件下連接過夜，連接產(chǎn)物命名為ｐＧＥＭ－Ｔ－ｒａｐ－１。連接產(chǎn)物的純化按照ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ試劑盒提供的操作方法進(jìn)行。

將２ μＬ連接產(chǎn)物ｐＧＥＭ－Ｔ－ｒａｐ－１加入到５０ μＬ感受態(tài)細(xì)胞ＪＭ１０９中，冰?。常?ｍｉｎ后，在４２ ℃水浴中熱激９０ ｓ，再冰?。?ｍｉｎ，加入預(yù)熱好的ＬＢ培養(yǎng)液９５０ μＬ，于３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)１ ｈ，離心，棄上清液，留下２００ μＬ菌液均勻涂在含Ａｍｐ、ＩＰＴＧ和Ｘ－Ｇaｌ的ＬＢ平板上，３７ ℃條件下培養(yǎng)過夜。

１．２．６陽性轉(zhuǎn)化子的ＰＣＲ法和酶切法鑒定挑取白色菌落置于含Ａｍｐ的ＬＢ液體培養(yǎng)基中。振蕩培養(yǎng)過夜，按照質(zhì)粒提取試劑盒操作流程從陽性轉(zhuǎn)化菌中提?。穑牵牛停裕颍幔穑辟|(zhì)粒，并對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行ＰＣＲ鑒定，反應(yīng)條件及ＰＣＲ產(chǎn)物檢測方法同１．２．３。用ＥｃｏＲ Ｉ對(duì)ｐＧＥＭ－Ｔ－ｒａｐ－１質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。酶切體系：ｐＧＥＭ－Ｔ－ｒａｐ－１ ５ μＬ，１０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，ＥｃｏＲ Ｉ １ μＬ，滅菌水１２ μＬ，總體積為２０ μＬ。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切情況。

１．２．７陽性克隆產(chǎn)物序列測定與比較分析ＰＣＲ法和酶切法鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒由寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行序列測定。將所測得的序列用ＢＬＳＡＴ軟件分析核苷酸序列與ＧｅｎＢａｎｋ中序列的同源性。

２結(jié)果與分析

２．１目的基因的ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果

ＰＣＲ擴(kuò)增蘭州株牛雙芽巴貝斯蟲ｒａｐ－１，該基因長度為８４６ ｂｐ，ＰＣＲ反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)產(chǎn)物３ μＬ在１％瓊脂糖凝膠（含０．５ μｇ／ｍＬ溴化乙錠）中電泳，出現(xiàn)預(yù)期大小的目的條帶，結(jié)果見圖１。

２．２重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

用ＥｃｏＲ Ｉ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切后，?。?μＬ進(jìn)行１％瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切結(jié)果，電泳顯示在３ ０００ ｂｐ附近和８００ ｂｐ附近都出現(xiàn)了明顯的條帶，說明ＥｃｏＲ Ｉ已將ｐＧＥＭ－Ｔ－ｒａｐ－１切成兩段：ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ和ｒａｐ－１，表明成功地克隆了ｒａｐ－１基因（圖２）。

２．３ｒａｐ－１序列的測定與比較分析

克隆的ｒａｐ－１基因序列經(jīng)寶生物工程（大連）有限公司測定，結(jié)果表明，將rａｐ－１基因與pGEM-T Easy Vector相連，插入的片段長度為846 ｂｐ。蘭州株牛雙芽巴貝斯蟲的ｒａｐ－１與巴西株牛雙芽巴貝斯蟲的相應(yīng)序列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號(hào)：Ｎｏ． ＡＦ０１４４８６．１）相比具有很高的同源性，同源性為９９．７４％。

３結(jié)論與討論

本研究成功地克隆了蘭州株牛雙芽巴貝斯蟲的ｒａｐ－１基因，該基因全長８４６ ｂｐ，與巴西株牛雙芽巴貝斯蟲的相應(yīng)序列的同源性高達(dá)９９．７４％。

近幾年，科學(xué)家在研究牛雙芽巴貝斯蟲侵襲紅細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，位于蟲體被膜上的表面蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞結(jié)合之后才能完成蟲體入侵紅細(xì)胞這一過程［７］。

已有資料表明，牛雙芽巴貝斯蟲頂端復(fù)雜的細(xì)胞器可以直接導(dǎo)致宿主細(xì)胞的入侵以及蟲體液泡［８］的形成和維持。棒狀體在蟲體入侵宿主細(xì)胞的同時(shí)被排出，對(duì)于巴貝斯蟲屬而言，棒狀體的排出發(fā)生在紅細(xì)胞入侵和蟲體液泡形成的同時(shí)，并且在此過程中，棒狀體很快溶解并消失。

牛雙芽巴貝斯蟲的Rａｐ－１在牛體內(nèi)可引發(fā)免疫防御反應(yīng)，Rａｐ－１在羧基端和氨基端分別有兩個(gè)二態(tài)形的序列區(qū)域，氨基端１型（ＮＴ－１）存在于表面暴露的Ｂ細(xì)胞抗原決定簇中，羧基端１型（ＣＴ－１）存在于ＣＤ４＋Ｔ細(xì)胞抗原決定簇中［７］。

Ｈｏｔｚｅｌ等［９］在試驗(yàn)中采用墨西哥株ＪＧ－２９雙芽巴貝斯蟲體［１０］發(fā)現(xiàn)每一個(gè)基因都包含一個(gè)二態(tài)形的序列，在氨基端和羧基端分別編碼氨基酸序列。

由此可見，Rａｐ－１對(duì)牛雙芽巴貝斯蟲來講是一種非常重要的表面蛋白質(zhì)，通過這種蛋白質(zhì)的活動(dòng)，牛雙芽巴貝斯蟲干擾宿主細(xì)胞的功能，一方面，牛雙芽巴貝斯蟲獲得生存的機(jī)會(huì)，另一方面使宿主紅細(xì)胞崩解，蟲體進(jìn)入下一階段的生活史。

研究ｒａｐ－１基因及其編碼的蛋白質(zhì)已成為治療和預(yù)防牛雙芽巴貝斯蟲病的一個(gè)焦點(diǎn)，中國尚未開展這方面的工作，本研究成功克隆了蘭州株牛雙芽巴貝斯蟲的ｒａｐ－１基因，通過多次測序該基因存在突變，將其與ＧｅｎＢａｎｋ中巴西株牛雙芽巴貝斯蟲的ｒａｐ－１基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示序列之間同源性高達(dá)９９．７４％，證明ｒａｐ－１基因是高度保守的，僅有兩個(gè)堿基的突變。由核苷酸序列推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列發(fā)現(xiàn)此堿基突變?yōu)闊o義突變，其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變。

牛雙芽巴貝斯蟲ｒａｐ－１基因的克隆為該基因的表達(dá)及生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。作為藥物靶點(diǎn)［11，12］的Rａｐ－１的結(jié)構(gòu)功能和遠(yuǎn)期的藥物結(jié)合特性研究對(duì)研制治療牛雙芽巴貝斯蟲病的主動(dòng)靶向制劑具有重要意義。

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