蘆慧 魏賽金 涂曉嶸 徐佳 涂國(guó)全

摘要：離體條件下，采用菌絲生長(zhǎng)速率法和菌絲干重法測(cè)定新型多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素——抗真菌霉素７０２和制霉色基素對(duì)水稻紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、水稻菌核病菌（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｉｇｍｏｉｄｅｕｍ Ｃａｖ．）、稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、稻曲病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｒｅｎｓ）４種水稻病原真菌的抗菌活性和毒力。結(jié)果表明，抗真菌霉素７０２和制霉色基素對(duì)４種水稻病原真菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，５０ μｇ／ｍＬ抗真菌霉素７０２對(duì)水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的抑菌率分別為１００．００％、１００．００％、９１．７２％和６８．０６％， ＥＣ５０分別為７．００、１０．３０、１４．４１、２６．７１ μｇ／ｍＬ， ＥＣ９０分別為１３．２０、１７．６６、２７．６７、１２８．２８ μｇ／ｍＬ。１３ μｇ／ｍＬ制霉色基素對(duì)水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的抑菌率分別為７８．２０％、１００．００％、１００．００％和７９．１７％， ＥＣ５０分別為１．４７、１．９１、２．３７、０．２０ μｇ／ｍＬ，ＥＣ９０分別為４１．０５、３．９２、４．３４、１３５．５４ μｇ／ｍＬ?？傮w上，制霉色基素對(duì)４種水稻病原真菌的抑菌活性強(qiáng)于抗真菌霉素７０２。

關(guān)鍵詞：鏈霉菌７０２；抗真菌霉素７０２；制霉色基素；抗菌活性；水稻病原真菌

中圖分類號(hào)：Ｓ４５１．２１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）06－1123-05

Studies on Antifungal Activity and Toxicity ofNew type Polyene Antibiotics on Four Kinds of Rice Pathogenic Fungi

ＬＵ Ｈｕｉ，ＷＥＩ Ｓａｉ－ｊｉｎ，ＴＵ Ｘｉａｏ－ｒｏｎｇ，ＸＵ Ｊｉａ，ＴＵ Ｇｕｏ－ｑｕａｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ，３３００４５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｐｏｌｙｅｎｅ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ-Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｙｃｉｎ ７０２ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ ｏｎ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ， Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｉｇｍｏｉｄｅｕｍ Ｃａｖ．， Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ａｎｄ Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｒｅｎｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｍｙｃｅｌｉａ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｈｙｐｈａ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ vitro． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｂｏｔｈ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｙｃｉｎ ７０２ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ． Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ５０μｇ／ｍＬ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｙｃｉｎ ７０２， ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅｓ ｏｎ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ， Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｉｇｍｏｉｄｅｕｍ Ｃａｖ．， Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ａｎｄ Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｒｅｎｓ ｗｅｒｅ １００．００％， １００．００％， ９１．72％ ａｎｄ ６８．06％， ａｎｄ ｔｈｅ ＥＣ５０ （μｇ／ｍＬ） ａｎｄ ＥＣ９０ （μｇ／ｍＬ） ｗｅｒｅ ７．００， １０．３０， １４．４１， ２６．７１ ａｎｄ １３．２０， １７．６６， ２７．６７， １２８．２８ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ １３μｇ／ｍＬ Ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ， ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｗｅｒｅ ７８．２０％，１００．００％，１００．００％ ａｎｄ ７９．１７％， ａｎｄ ｔｈｅ ＥＣ５０ （μｇ／ｍＬ） ａｎｄ ＥＣ９０（μｇ／ｍＬ） ｗｅｒｅ １．４７， １．９１， ２．３７， ０．２０ ａｎｄ ４１．０５， ３．９２， ４．３４， １３５．５４ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｙｃｉｎ ７０２．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ７０２； Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｙｃｉｎ ７０２； Ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ； ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｒｉｃｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院南昌市發(fā)酵應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行以棉花枯萎病為靶標(biāo)的農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選研究中，從棉田土壤中分離篩選到一株鏈霉菌，編號(hào)７０２。該菌所產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)在微量濃度下對(duì)細(xì)菌、霉菌和酵母菌均有極強(qiáng)的抑制作用［１］。從鏈霉菌７０２的發(fā)酵液中提取到抗細(xì)菌單體活性組分Ｓ２和抗真菌活性單體組分ＤＺＰ－８及ＤＺＰ－９，分別進(jìn)行了鑒定?？辜?xì)菌單體活性組分Ｓ２在中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化合物研究所協(xié)助下鑒定為９種氨基酸組成的環(huán)肽，分子質(zhì)量

１ ２６９ u，分子式Ｃ６２Ｈ８４Ｎ１２Ｏ１７，為國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)和鑒定，命名紅谷霉素［２］。抗真菌活性單體組分在中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所協(xié)助下進(jìn)行鑒定，抗真菌活性單體組分ＤＺＰ－９和ＤＺＰ－８均為多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素。ＤＺＰ－９分子質(zhì)量和分子式分別為６７０ u和Ｃ３５Ｈ５８Ｏ１２，ＤＺＰ－８的分子質(zhì)量和分子式分別為為７０４ u和Ｃ３５Ｈ６０Ｏ１４。通過ＣＡＳ檢索結(jié)構(gòu)式發(fā)現(xiàn)ＤＺＰ－９與已知的制霉色基素（Ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ）同質(zhì)［３－５］，ＤＺＰ－８未見報(bào)道，是一種新型多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，命名為抗真菌霉素７０２（Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｙｃｉｎ ７０２）。多烯類抗生素是一類目前臨床常用藥中最不容易產(chǎn)生抗藥性的抗真菌抗生素［６，７］，開發(fā)高效低毒的多烯類抗真菌抗生素是抗真菌藥物研發(fā)的有效途徑之一。

本試驗(yàn)研究抗真菌霉素７０２和制霉色基素對(duì)水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌４種水稻病原真菌的抗菌活性和毒力。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)材料

１．１．１抗真菌活性物質(zhì)抗真菌活性物質(zhì)ＤＺＰ－８，即抗真菌霉素７０２ （純度９９．４６％）；ＤＺＰ－９，即制霉色基素（純度９９．５７％），均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室提供，用甲醇溶解配成１ ０００ ｍｇ／Ｌ和１３０ ｍｇ／Ｌ溶液。

１．１．２供試菌水稻紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、水稻菌核病菌（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｉｇｍｏｉｄｅｕｍ Ｃａｖ．）、稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、稻曲病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｒｅｎｓ）菌株由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實(shí)訓(xùn)基地提供。

１．１．３培養(yǎng)基供試菌斜面、平板培養(yǎng)基均采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（ＰＤＡ）；液體培養(yǎng)基采用ＰＤ培養(yǎng)基。

１．２試驗(yàn)方法

１．２．１抗真菌霉素７０２和制霉色基素對(duì)３種水稻病原真菌的毒力鑒定將水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌菌株接種至ＰＤＡ平板上，水稻紋枯病菌和水稻菌核病菌于３０ ℃培養(yǎng)２ ｄ，稻瘟病菌于２７ ℃培養(yǎng)４ ｄ，用內(nèi)徑８．８ ｍｍ打孔器打取菌落邊緣菌絲作為接種物。

采用菌絲生長(zhǎng)速率法［８］進(jìn)行毒力鑒定。將抗真菌霉素７０２和制霉色基素藥液分別稀釋１、２、４、８、１６倍，吸?。?ｍＬ不同濃度的藥液與９ ｍＬ冷卻至５０ ℃的ＰＤＡ培養(yǎng)基充分混勻制成系列濃度的含藥平板，以添加等量無菌水的平板為空白對(duì)照（ＣＫ）。用打孔器打取水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌菌餅，將菌餅移至各含藥平板中央，適溫培養(yǎng)，同一處理重復(fù)３次。對(duì)照平板上菌落布滿培養(yǎng)皿２／３時(shí)，用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量并記錄各菌落直徑，菌絲凈生長(zhǎng)量為菌落直徑與菌餅直徑之差，菌絲生長(zhǎng)抑制率（抑菌率）按以下公式計(jì)算：

抑菌率＝

■×100%。

計(jì)算抗真菌霉素７０２和制霉色基素對(duì)水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑菌率。利用ＤＰＳ統(tǒng)計(jì)軟件采用劑量對(duì)數(shù)－抑菌率機(jī)率值法［９］計(jì)算ＥＣ５０、ＥＣ９０及毒力回歸方程。

１．２．２抗真菌霉素７０２和制霉色基素對(duì)稻曲病菌的抑制作用和毒力鑒定采用菌絲干重法［１０］。將稻曲病菌菌株接種于３０ ｍＬ ＰＤ液體培養(yǎng)基中，于２６ ℃ １６０ r／ｍｉｎ搖床培養(yǎng)，制備均一的出發(fā)菌株。將不同濃度的抗真菌霉素７０２和制霉色基素加入已滅菌的ＰＤ培養(yǎng)基中制備成不同含藥量的培養(yǎng)基，再接入等量均一的稻曲病菌，置于２６ ℃ １６０ ｒ／ｍｉｎ搖床振蕩培養(yǎng)６ ｄ。取２張定量濾紙?jiān)诜治鎏炱缴戏Q重，質(zhì)量分別記為ａ１和ｂ１。取某一處理濃度培養(yǎng)下的供試菌培養(yǎng)物用ａ１過濾并收集濾液，瀝干后將附有菌絲體的濾紙稱重記為ａ２；取濾液用ｂ１過濾，瀝干后將濾紙稱重記為ｂ２，菌體質(zhì)量＝（ａ２－ａ１）＋（ｂ２－ｂ１）。利用上述方法測(cè)出抗真菌霉素７０２和制霉色基素不同濃度作用下稻曲病菌的菌體質(zhì)量。以不含抗真菌霉素７０２和制霉色基素的ＰＤ培養(yǎng)基為空白對(duì)照，計(jì)算２種藥劑對(duì)稻曲病菌的抑菌率，同一處理重復(fù)３次。利用ＤＰＳ統(tǒng)計(jì)軟件，采用劑量對(duì)數(shù)－抑菌率機(jī)率值法計(jì)算ＥＣ５０、ＥＣ９０及毒力回歸方程。

２結(jié)果與分析

２．１抗真菌霉素７０２對(duì)水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑制作用和毒力

抗真菌霉素７０２對(duì)水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌具有較強(qiáng)的抑制作用。由試驗(yàn)結(jié)果（表１）可知，５０ μｇ／ｍＬ抗真菌霉素７０２對(duì)水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑菌率分別達(dá)到１００．００％、１００．００％和９１．７２％；ＥＣ５０和ＥＣ９０分別為７．００、１０．３０、１４．４１ μｇ／ｍＬ和１３．２０、１７．６６、２７．６７ μｇ／ｍＬ。比較各處理ＥＣ５０和ＥＣ９０值可知，抗真菌霉素７０２對(duì)水稻紋枯病菌的ＥＣ５０和ＥＣ９０最低，抑菌活性最強(qiáng)。

２．２制霉色基素對(duì)水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑制作用和毒力

由制霉色基素對(duì)水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌的抑制作用和毒力測(cè)定結(jié)果（表２）可見，１３ μｇ／ｍＬ制霉色基素對(duì)水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑菌率分別為７８．２０％、１００．００％和１００．００％；ＥＣ５０和ＥＣ９０分別為１．４７、１．９１、２．３７ μｇ／ｍＬ 和４１．０５、３．９２、４．３４ μｇ／ｍＬ。綜合比較各處理的ＥＣ５０和ＥＣ９０值可知，制霉色基素對(duì)這３種病原菌的抑菌活性由強(qiáng)到弱依次為水稻菌核病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌。

２．３抗真菌霉素７０２和制霉色基素對(duì)稻曲病菌抑制作用和毒力

采用菌絲干重法測(cè)定抗真菌霉素７０２和制霉色基素對(duì)稻曲病菌的抑制作用和毒力，測(cè)定結(jié)果見表３。從表３可見，抗真菌霉素７０２和制霉色基素對(duì)稻曲病菌均有一定抑制效果，５０ μｇ／ｍＬ抗真菌霉素７０２對(duì)稻曲病菌的抑菌率為６８．０６％，而１３ μｇ／ｍＬ制霉色基素對(duì)稻曲病菌的抑菌率可達(dá)７９．１７％，其ＥＣ５０分別為２６．７１、０．２０ μｇ／ｍＬ，ＥＣ９０分別為１２８．２８、１３５．５４ μｇ／ｍＬ。

３小結(jié)與討論

３．１抗真菌霉素７０２和制霉色基素對(duì)水稻４種病原真菌的抑菌活性和毒力比較

抗真菌霉素７０２和制霉色基素是鏈霉菌７０２菌株所產(chǎn)的２種抗真菌單體組分，對(duì)水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌均有較強(qiáng)的抑制作用，且對(duì)不同病原菌的抑制作用差異較大。抗真菌霉素７０２對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌活性最強(qiáng)，其次為水稻菌核病菌、稻瘟病菌、稻曲病菌。制霉色基素對(duì)水稻菌核病菌抑菌活性最強(qiáng)，其次為稻瘟病菌、水稻紋枯病菌、稻曲病菌。抗真菌霉素７０２在５０ μｇ／ｍＬ時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的抑菌率分別為１００．００％、１００．００％、９１．72％和６８．０６％，而制霉色基素在濃度僅為１３ μｇ／ｍＬ時(shí)對(duì)這４種病原菌的抑菌率則分別達(dá)到７８．２０％、１００．００％ 、１００．００％和７９．１７％，抑制作用明顯強(qiáng)于抗真菌霉素７０２。毒力測(cè)定結(jié)果顯示，抗真菌霉素７０２對(duì)４種水稻病原菌的ＥＣ５０為７．００～２６．７１ μｇ／ｍＬ，ＥＣ９０為１３．２０～１２８．２８ μｇ／ｍＬ；制霉色基素對(duì)４種水稻病原菌的ＥＣ５０為０．２０～２．３７ μｇ／ｍＬ，ＥＣ９０為３．９２～１３５．５４ μｇ／ｍＬ，綜合比較可知，制霉色基素對(duì)這４種水稻病原菌的毒力強(qiáng)于抗真菌霉素７０２。

３．２抗真菌霉素７０２和制霉色基素的分子式相似但抑菌活性差異較大的原因分析

抗真菌霉素７０２和制霉色基素的分子式非常相似，抗真菌霉素７０２的分子質(zhì)量比制霉色基素多３４ u，相當(dāng)于多２個(gè)ＯＨ基，但試驗(yàn)結(jié)果顯示二者抑菌活性差異較大。分析原因，可能是因?yàn)槠浠瘜W(xué)立體結(jié)構(gòu)不相同，兩組分的化學(xué)立體結(jié)構(gòu)差異有待于進(jìn)一步通過Ｘ衍射試驗(yàn)來確定，從而從化學(xué)立體結(jié)構(gòu)上的差異來解釋2組分抑菌活性不同的原因。如青霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中不僅β－內(nèi)酰胺鍵的化學(xué)活性影響其抑菌活性，分子母核的其他結(jié)構(gòu)特征也起著重要作用［１１］。

抗真菌霉素７０２和制霉色基素均為新型多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素，對(duì)于多烯類抗生素的抑菌活性機(jī)理，還未有精確闡釋的文獻(xiàn)報(bào)道。目前研究一般認(rèn)為，多烯類抗生素抑菌機(jī)理主要體現(xiàn)在對(duì)病原菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能的破壞上［１２，１３］，如納他霉素（Ｎａｔａｍｙｃｉｎ）主要作用于真菌細(xì)胞質(zhì)膜，與質(zhì)膜中含有的麥角甾醇作用損傷細(xì)胞質(zhì)膜，造成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而起到抑菌作用［１４，１５］?？拐婢顾兀罚埃埠椭泼股貙?duì)水稻病原真菌的抑菌作用機(jī)理是否與納他霉素相似、是否還存在其他作用機(jī)制導(dǎo)致二者抑菌效果的較大差異，還有待于進(jìn)一步研究。

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