張艷玲, 鄒本良

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高糖對小鼠胰島和胰島b細(xì)胞株INS-1E的長期作用

張艷玲1*, 鄒本良2

（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院:1教育處,2內(nèi)分泌科, 北京 100091）

探討高糖對胰島b細(xì)胞INS-1E和小鼠胰島的慢性作用。雌性NMRI小鼠, 6～10周齡, 苯巴比妥腹腔注射麻醉, 應(yīng)用膠原酶技術(shù)消化胰腺分離胰島。傳代培養(yǎng)的INS-1E細(xì)胞和分離的小鼠胰島分別于含11.1, 25.0 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h, 然后于含3.3, 16.7 mmol/L葡萄糖的Krebs-Ringer緩沖液中培養(yǎng)60 min, 留取上清液行胰島素測定。INS-1E細(xì)胞在含不同濃度的葡萄糖的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h, 提取其總RNA, 合成相應(yīng)的cDNA, 再行RT-PCR檢測胰十二指腸同源異形盒-1（Pdx1）, 胰島素1（Ins1）, 胰島素2（Ins2）和葡萄糖轉(zhuǎn)運子2（Glut2）的基因表達(dá)。高糖培養(yǎng)后INS-1E細(xì)胞和小鼠胰島的基礎(chǔ)INS分泌增加[INS-1E細(xì)胞:（10.47±0.78）（7.71±0.59）ng/10000細(xì)胞,＜0.01; 小鼠胰島:（3.85±0.26）（2.18±0.21）mg/L,＜0.001], 糖刺激的INS分泌減少[INS-1E細(xì)胞:（17.11±1.98）（30.76±2.20）ng/10000細(xì)胞,＜0.001; 小鼠胰島:（14.78±1.03）（20.46±1.49）mg/L,＜0.01];高糖處理后INS-1E細(xì)胞的Pdx1, Ins1, Ins2和Glut2的mRNA水平下降。高糖對胰島β細(xì)胞具有慢性毒性作用。

葡萄糖; 胰島素分泌細(xì)胞; INS-1E細(xì)胞

胰島b細(xì)胞分泌胰島素（insulin, INS）減少和INS抵抗是2型糖尿?。╰ype 2 diabetes, T2D）的主要發(fā)病機制。研究發(fā)現(xiàn), 糖耐量減退的患者和T2D患者的早期即呈現(xiàn)特征性胰島β細(xì)胞功能不全[1]。T2D是一種進(jìn)行性進(jìn)展性疾病, 研究發(fā)現(xiàn), 波動性或持續(xù)性高血糖可能對胰島β細(xì)胞造成持續(xù)性損害, 導(dǎo)致β細(xì)胞功能不全進(jìn)行性加重, 但尚無一致性結(jié)論。本研究應(yīng)用小鼠胰島和克隆的β細(xì)胞株INS-1E細(xì)胞, 探討了過多葡萄糖可能對胰島β細(xì)胞的慢性毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、牛血清白蛋白、N-2-羥乙哌嗪-N-2-乙烷磺酸（HEPES）、RPMI 1640均購自Sigma公司; 自行配制Krebs-Ringer緩沖液（主要成分為115 mmol/L氯化鈉、4.7 mmol/L氯化鉀、1.28 mmol/L氯化鈣、5.0 mmol/L碳酸氫鈉、25 mmol/L HEPES, pH 7.4）, INS-1E細(xì)胞由C.B.Wollheim教授（瑞士）饋贈。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

INS-1E細(xì)胞的培養(yǎng)液為改良的RPMI1640（含有10%胎牛血清, 11.1 mmol/L葡萄糖, 10 mmol/L HEPES, 100 IU/ml青霉素, 100 mg/L鏈霉素, 0.5%牛血清白蛋白）, 細(xì)胞在細(xì)頸瓶中貼壁生長, 每周傳代1次。

1.3 INS-1E細(xì)胞釋放胰島素

應(yīng)用胰酶消化, 培養(yǎng)液稀釋, 離心收集INS-1E細(xì)胞, 種植在24孔板中, 每孔1 ml, 2.5×106/孔, 37℃、5%CO2培養(yǎng)1 d, 然后分別于11.1, 25.0 mmol/L葡萄糖的RPMI1640中培養(yǎng)72 h。經(jīng)不同濃度葡萄糖處理后, INS-1E細(xì)胞在Krebs-Ringer緩沖液預(yù)培養(yǎng)15 min;而后每孔中加入含3.3或者16.7 mmol/L葡萄糖的Krebs-Ringer緩沖液1 ml培養(yǎng)1 h, 每孔留取200 μl上清液－20℃保存待測。

1.4 INS-1E細(xì)胞計數(shù)

移出每孔中剩余的培養(yǎng)液, 加入蒸餾水1 ml, 于FLUOstar Galaxy細(xì)胞計數(shù)儀上進(jìn)行本底測定, 然后加入20ml SYTO24試劑（SYTO24溶于0.01 mmol/L二甲基亞砜中）, 37℃培養(yǎng)箱放置45 min后對細(xì)胞核進(jìn)行染色, 再次于FLUOstar Galaxy細(xì)胞計數(shù)儀上進(jìn)行細(xì)胞數(shù)測定。以細(xì)胞數(shù)來校正INS水平。

1.5 INS-1E細(xì)胞的基因表達(dá)

INS-1E細(xì)胞分別于含11.1, 25.0 mmol/L葡萄糖的RPMI1640中培養(yǎng)72 h, 應(yīng)用RNeasy mini試劑盒（Qiagen公司, 德國）, 提取INS-1E細(xì)胞總RNA。應(yīng)用iScriptTMcDNA合成試劑盒（Bio-Rad公司, 美國）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcription, RT）, 每20ml RT體系中加入1mg總RNA。在ABI 7500快速多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）儀上進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。相關(guān)基因的探針和引物為: 胰十二指腸同源異形盒-1（pancreas-duodenum homeobox-1, Pdx1, Rn00755591_m1）, 胰島素 1（insulin 1, Ins1, Rn02121433_g1）, 胰島素 2（insulin 2, Ins2, Rn01774648_g1）, 葡萄糖轉(zhuǎn)運子2（glucose transporter type 2, Glut2, Rn00563565_m1）, 均購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。RT-PCR的反應(yīng)體系如下:5ml 2×TaqMan Universal Master 混合液, 0.5ml 20×TaqMan 探針, 與50 ng總RNA相當(dāng)?shù)腸DNA水溶液。熱循環(huán)如下: 95℃ 20 s, 95℃ 40循環(huán)（每個循環(huán)3 s）, 60℃ 30 s。以真核細(xì)胞18 s核糖體RNA為管家基因, 應(yīng)用2-CT的方法計算基因的相對表達(dá)[2]。

1.6 小鼠胰島的分離和培養(yǎng)

雌性NMRI小鼠購自丹麥Bomholtgaard飼養(yǎng)研究中心, 飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料和瓶裝自來水。實驗時, 苯巴比妥腹腔注射麻醉, 腹腔正中切口, 胰臟管道注入3 ml冰浴的Hanks平衡鹽溶液（0.3 mg膠原酶P/ml）, 取出胰腺, 37℃水浴箱中溫浴19 min后, 用冰浴的Hanks平衡鹽溶液洗滌3次, 體視顯微鏡下挑選胰島, 迅速轉(zhuǎn)移到含RPMI1640的培養(yǎng)皿中, 37℃培養(yǎng)箱（5%CO2, 95%空氣）過夜培養(yǎng)。第二天小鼠胰島分別轉(zhuǎn)移到含11.1, 25.0 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h。

1.7 小鼠胰島釋放胰島素

小鼠胰島經(jīng)上述處理后, 在加有0.1%牛血清白蛋白, 3.3 mmol/L葡萄糖的10 ml Krebs-Ringer緩沖液中, 37℃水浴箱預(yù)培養(yǎng)15 min。然后單個胰島分別小心地置入100ml含3.3或16.7 mmol/L葡萄糖的Krebs-Ringer緩沖液中, 37℃培養(yǎng)1 h, 從每孔胰島中吸取50ml上清夜, －20℃保存待測。

1.9 胰島素的測定

應(yīng)用大鼠INS（Novo Nordisk, 丹麥）作為標(biāo)準(zhǔn), 單125碘標(biāo)記的人INS（Novo Nordisk A/S, 丹麥）作示蹤劑, 應(yīng)用豚鼠抗豬INS抗體（Novo Nordisk A/S, 丹麥）進(jìn)行放射免疫測定INS, 應(yīng)用乙醇分離自由的和結(jié)合的放射活性, 批內(nèi)變異系數(shù)5%, 批間變異系數(shù)10%。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 高糖對INS-1E細(xì)胞分泌INS的影響

高濃度葡萄糖處理后, INS-1E細(xì)胞的基礎(chǔ)INS分泌增加, 葡萄糖刺激的INS-1E細(xì)胞的INS分泌反應(yīng)下降（表1）。

表1 高糖處理后INS-1E細(xì)胞分泌INS的變化

注: 與11.1 mmol/L葡萄糖組比較,**＜0.01,***＜0.001

2.2 高糖對小鼠胰島分泌INS的影響

高濃度葡萄糖處理后, 小鼠胰島的基礎(chǔ)INS分泌增加, 葡萄糖刺激的小鼠胰島分泌INS的反應(yīng)下降（表2）。

2.3 高糖培養(yǎng)后INS-1E細(xì)胞基因表達(dá)的改變

如圖1所示, 高糖處理后, INS-1E細(xì)胞Pdx1, Ins1, Ins2, Glut2的mRNA水平較對照組明顯下降。

表2 高糖處理后小鼠胰島分泌INS的變化

注: 與11.1 mmol/L葡萄糖組比較,**＜0.01,***＜0.001

圖1 高濃度葡萄糖培養(yǎng)對INS-1E細(xì)胞Pdx1, Ins1, Ins2, Glut2 mRNA水平的影響

Figure 1 Effect of higher glucose concentration on Pdx1, Ins1, Ins2, Glut2 mRNA in INS-1E cells

A: Pdx1; B: Ins1; C: Ins2; D: Glut2。與11.1 mmol/L葡萄糖組比較,*＜0.05,**＜0.01

3 討 論

T2D起病和進(jìn)行性發(fā)展的根本原因是胰島β細(xì)胞功能的進(jìn)行性減退[1], T2D前期和T2D患者的高血糖和高血脂被認(rèn)為是胰島β細(xì)胞功能減退的重要原因, 但尚未得出一致結(jié)論。本研究應(yīng)用克隆的胰島β細(xì)胞株和分離的小鼠胰島證實, 慢性高血糖可以引起胰島β細(xì)胞功能減退, 即β細(xì)胞的基礎(chǔ)INS分泌增加, 葡萄糖刺激的INS分泌減退。本研究顯示, 慢性過多葡萄糖通過下調(diào)促INS轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子Pdx1的表達(dá), 減少了INS基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá), 進(jìn)而導(dǎo)致葡萄糖刺激的INS分泌下降。

高糖培養(yǎng)后葡萄糖刺激的INS分泌減退不僅發(fā)生在INS-1E細(xì)胞, Robertson等[3]最早在高糖的條件下培養(yǎng)克隆的β細(xì)胞株HIT-T15, 發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)數(shù)代后, HIT-T15細(xì)胞的INS含量和INS mRNA 水平明顯下降, 其葡萄糖刺激的INS分泌下降; 而改用低濃度葡萄糖培養(yǎng)后其INS含量和mRNA水平得以部分恢復(fù)。而Brock等[4]應(yīng)用克隆的β細(xì)胞株INS-1 細(xì)胞, 在高糖環(huán)境下培養(yǎng)4 d, 其INS mRNA水平較對照組減少90%, 并且高糖和低糖每天交替培養(yǎng)亦不能阻止mRNA水平的下降, 同時INS-1細(xì)胞也顯示了葡萄糖刺激的INS分泌的下降。El-Assaad等[5]應(yīng)用β細(xì)胞株INS832/13, 證實單純高脂培養(yǎng), 其葡萄糖刺激的INS分泌無變化, 高糖培養(yǎng)后其葡萄糖刺激的INS分泌下降, 而高糖聯(lián)合高脂培養(yǎng)后其葡萄糖刺激的INS分泌下降更明顯。本組研究證實, 高糖培養(yǎng)后小鼠胰島的葡萄糖刺激的INS分泌減退, 而Khaldi 等[6]發(fā)現(xiàn), 大鼠胰島在高糖環(huán)境下培養(yǎng)1周, 胰島β細(xì)胞的基礎(chǔ)INS分泌增加, 葡萄糖刺激的INS分泌下降。Harmon等[7]應(yīng)用ZDF糖尿病大鼠（Zucker diabetic fatty rat, ZDF）觀察慢性高血糖在體內(nèi)對胰島β細(xì)胞的作用, 發(fā)現(xiàn)6周齡尚未成模大鼠的胰島INS mRNA水平較對照組代償性增加, 而15～16周齡成模ZDF大鼠胰島的INS mRNA和Pdx1 mRNA水平較對照組大鼠明顯下降, 其胰島的葡萄糖刺激的INS分泌較對照組大鼠下降。尤其重要的是, 從T2D患者分離的胰島也具有葡萄糖刺激的INS分泌減退的特征[8]。這些不同來源的β細(xì)胞都表現(xiàn)出高糖所致的相同的b細(xì)胞功能異常特征。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn), 慢性高血糖引致多元醇通路、己糖途徑、糖基化通路、蛋白激酶C同分異構(gòu)體的激活等異常增加, 反應(yīng)性氧簇（reactive oxygen species, ROS）的形成增加, 過多的ROS使Pdx1的表達(dá)下降[9], 而且Pdx1蛋白和INS基因啟動子的結(jié)合能力減退[7,9]。Pdx1是強力刺激INS基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子, 本研究、Robertson等[3]、Brock等[4]和Harmon等[7]的研究均證實, 慢性高糖導(dǎo)致克隆的β細(xì)胞和ZDF大鼠胰島的INS mRNA表達(dá)水平下降。而且本研究表明, 慢性高糖使Glut2 mRNA表達(dá)下降也是β細(xì)胞的葡萄糖刺激的INS分泌減退的一種可能原因, 因為Glut2位于β細(xì)胞膜, 促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運入β細(xì)胞, 是葡萄糖刺激INS分泌的必須環(huán)節(jié)。Lombardi等[10]的研究則證實, 高糖培養(yǎng)后, INS-1E細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激, 導(dǎo)致Pdx1, Ins1, Glut2 mRNA水平下降, 結(jié)果INS-1E細(xì)胞的葡萄糖刺激的INS分泌減退。

綜上所述, 長期過多葡萄糖可能通過下調(diào)Pdx1和Glut2的表達(dá), 影響INS mRNA的表達(dá)和葡萄糖在β細(xì)胞內(nèi)的代謝, 導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能減退, 這可能是T2D發(fā)病和進(jìn)行性發(fā)展的重要原因。

4 致謝

感謝丹麥奧胡斯大學(xué)醫(yī)院Per Bendix Jeppesen的技術(shù)指導(dǎo)。

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（編輯: 任開環(huán)）

Chronic effects of high glucose concentration on function of isolated mouse islets and islet β cell line INS-1E

ZHANG Yanling, ZOU Benliang

(Department of Education, Department of Endocrinology, Xiyuan Hospital, Chinese Academy of Chinese medicine, Beijing 100091, China)

To explore the chronic effects of excess glucose on INS-1E cells and isolated mouse islets.Islets were isolated by the collagenase digestion from adult female NMRI mice (6-10 weeks) after induction of anesthesia by phenpbarbital. INS-1E cells and isolated mouse islets were cultured in RPMI 1640 supplemented with 11.1 or 25.0 mmol/L glucose for 72 h, respectively. Then the medium were changed to Krebs-Ringer buffer containing 3.3 or 16.7 mmol/L glucose and incubated for 1 h. Correspondingly upper medium was collected for insulin assay. Total RNA was extracted from INS-1E cells after 72 h incubation with different concentration of glucose, then cDNA was synthesized and mRNA expressions of Pdx1, insulin 1, insulin 2, and GLUT2 were determined by RT-PCR.After incubation with excess glucose, basal insulin secretion was increased in both INS-1E cells and isolated mouse islets [INS-1E cells: (10.47±0.78)(7.71±0.59) ng/10000 cells,＜0.01; isolated mouse islets: (3.85±0.26)(2.18±0.21)mg/L,＜0.001], and glucose-stimulated insulin secretion was impaired [INS-1E cells: (17.11±1.98)(30.76±2.20) ng/10000 cells,＜0.001; isolated mouse islets:(14.78±1.03)(20.46±1.49)mg/L,＜0.01]. Pdx1, insulin 1, insulin 2, and GLUT2 mRNA levels were reduced in INS-1E cells after treatment of excess glucose.Long-term exposure to supraphysiologic glucose concentrations may cause dysfunction of pancreatic islet cells.

glucose; insulin-secreting cells; INS-1E cell line

R587.1

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00055

2011-07-09;

2012-01-29

張艷玲, Tel: 010-62887973, E-mail: zhyllzhp@yahoo.com.cn