潘 宇, 蔡 颯, 朱杰寧, 林秋熊, 余細勇

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靶向干擾細胞周期檢驗點激酶2增強5-氟尿嘧啶對鼻咽癌細胞SUNE-1的毒性作用研究

潘 宇1, 蔡 颯2, 朱杰寧1, 林秋熊1, 余細勇1

（1廣東省人民醫(yī)院, 廣東省醫(yī)學科學院醫(yī)學研究中心, 廣州 510080;2深圳大學醫(yī)學院組織胚胎學教研室, 深圳 518060）

探討靶向抑制細胞周期檢驗點激酶2（Chk2）對5-氟尿嘧啶（5-FU）抗鼻咽癌鱗狀上皮細胞SUNE-1的增敏作用。根據(jù)Chk2基因設計siRNA干擾序列, 在mRNA和蛋白水平檢測其干擾效果; 通過細胞生長曲線觀察Chk2 siRNA對SUNE-1細胞增殖能力的影響; 通過細胞毒性試驗檢測Chk2 siRNA是否影響SUNE-1細胞對代謝類抗腫瘤藥5-FU的敏感性; 采用AnnexinⅤ/PI雙染方法檢測細胞凋亡的變化情況。所采用的siRNA在mRNA和蛋白水平均顯著降低SUNE-1細胞中Chk2表達, 驗證了該siRNA的干擾效果; Chk2 siRNA對SUNE-1細胞增殖能力無顯著影響, 但能顯著增強5-FU的細胞毒作用（＜0.05）; 細胞凋亡檢測結果顯示, Chk2 siRNA顯著增加5-FU引起的SUNE-1細胞凋亡水平。盡管Chk2對SUNE-1細胞生存和增殖不發(fā)揮關鍵作用, 但在5-FU引起的細胞損傷中對細胞起保護作用, 該作用與其抑制5-FU引起的細胞凋亡有關, 因此Chk2可成為在鼻咽癌治療中增強5-FU的療效的靶點。

抗腫瘤藥; 鼻咽癌; 5-氟尿嘧啶; 細胞周期檢驗點激酶; RNA干擾

作為目前常用的廣譜抗腫瘤藥之一, 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）廣泛用于治療多種實體腫瘤, 如鼻咽癌、消化道腫瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等。5-FU屬尿嘧啶抗代謝藥, 其藥理作用主要是通過抑制細胞DNA的合成, 引起DNA受損, 從而干擾腫瘤細胞的增殖。然而與多數(shù)腫瘤化療藥相似, 5-FU具有骨髓抑制等多種毒副作用, 可在用藥期間誘發(fā)患者嚴重不良反應。如何增加惡性腫瘤細胞對于該類化療藥物敏感性、增強藥效、減少用藥劑量和毒副反應的發(fā)生一直是抗腫瘤治療研究的重要課題[1]。

細胞周期檢驗點是機體細胞應答DNA損傷的主要機制之一, 其作用是在細胞增殖周期中保證DNA的完整性。DNA損傷可激活細胞周期檢驗點, 進而導致周期阻滯和DNA修復。對于惡性腫瘤細胞來說, 細胞周期檢驗點介導DNA損傷修復的作用可降低化療藥物對細胞的殺傷作用, 進而導致腫瘤耐藥[2-5]。因而, 以細胞周期檢驗點或DNA修復機制中關鍵蛋白為靶點的腫瘤治療策略可克服細胞周期檢驗點對化療藥物作用的影響, 從而增加腫瘤對DNA損傷劑的敏感性[6,7]。

細胞周期檢驗點激酶2（cell cycle checkpoint kinase 2, Chk2）在細胞周期檢驗點中非常關鍵, 通常對于DNA雙鏈斷裂等類型的損傷有較明顯的應答作用, 有關Chk抑制劑增加腫瘤細胞對DNA損傷劑敏感性的研究亦受到廣泛關注[8,9]。本文通過抑制Chk2表達, 觀察其對5-FU抗鼻咽癌細胞的細胞毒性影響。

1 材料與方法

1.1 藥品

5-FU購于Sigma公司。鼻咽低分化鱗狀上皮細胞癌細胞系SUNE-1由中山醫(yī)科大學腫瘤研究所惠贈, 本室保存, 以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液, 37℃、5% CO2培養(yǎng)。

1.3 RNA干擾序列設計

根據(jù)GenBank中提供的Chk2基因序列設計針對Chk2的siRNA序列（廣州銳博生物有限公司合成）: 5'-GAACCTGAGGACCAAGAACdTdT-3'; 選擇不針對任何基因的siRNA序列（mock siRNA）作為陰性對照: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’。

1.4 細胞轉染:

使用Lipofect AMINETM2000脂質體（Life Technologies公司, 美國）進行轉染, 所有操作按產品說明書進行。轉染后48 h進行基因干擾效果測定。

1.5 細胞生長抑制實驗

采用磺酰羅丹明B（Sulforhodamine, SRB）法檢測藥物的細胞毒作用。將處于對數(shù)生長期的貼壁細胞以200μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板, 貼壁生長24 h后轉染siRNA, 后于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。取出培養(yǎng)板, 每孔加入50％（m/V）的三氯乙酸50μl固定細胞, 4℃放置l h。棄固定液, 用蒸餾水洗滌5次, 空氣中自然干燥。每孔加SRB溶液100 μl, 室溫下放置10～30 min。去上清液, 1%醋酸洗滌5次, 空氣干燥。最后加入150 μl/孔的Tris溶液, 于平板振蕩器上振蕩5min。酶聯(lián)免疫檢測儀（Model3550, Bio-Rad）于515nm處測定OD值。設置三個復孔。

1.6 Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡

根據(jù)Annexin V/PI雙染試劑盒說明書（Biovision公司, 美國）進行操作, 流式細胞監(jiān)測儀檢測AnnexinⅤ陽性的凋亡細胞。

1.7 Western blot方法檢測Chk2表達

細胞轉染siRNA 48 h和72 h后, 用PBS沖洗2遍, 加入細胞裂解液, 4℃裂解20 min, 12 0004℃離心15 min, 收集上清液, Bradford法測蛋白濃度。將樣品加入到樣品槽中, 進行電泳。電泳完畢后, 在半干轉膜儀上轉膜。之后, 依次室溫振搖封閉2 h、一抗室溫孵育2 h、相應的二抗孵育1 h。洗膜后化學發(fā)光增強劑進行顯影。以b-actin作為內參對照。

1.8 RT-PCR方法檢測Chk2 mRNA水平

細胞轉染siRNA 48 h和72 h后, 采用TRIzol（Invitrogen公司, 美國）提取總RNA, 紫外分光光度計測定RNA的濃度和質量。采用Super-ScriptTM一步法RT-PCR試劑盒（Invitrogen公司, 美國）對mRNA水平進行檢測。反應體系為25 μl, 擴增反應時加入總RNA 1 μg作為模板。反應條件如下: 50℃×

30 min反轉錄, 之后94℃×30 s, 56℃×30 s, 72℃×45 s, 39個循環(huán), 最后延伸反應72℃×10 min。以GAPDH作為內參對照。反應完成后將產物進行瓊脂糖電泳, 凝膠成像儀照相并分析結果。RT-PCR引物如下: GAPDH上游引物5￠-CGGAGTCAACGGA-TTTGGTCGTAT-3￠, GAPDH下游引物5￠-GTCTT- CACCACCATGGAGAAGGCT-3￠; Chk2上游引物5￠-ATGTCTCGGGAG TCGGATGT-3￠, Chk2下游引物5￠-TCTTGCTGTATGTTCGGTAT-3￠。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS12.0軟件進行單因素方差分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SUNE-1細胞中Chk2 siRNA干擾效果檢測

將Chk2 siRNA轉染SUNE-1細胞, 48 h后通過RT-PCR方法檢測細胞內Chk2 mRNA水平, Western Blot法檢測蛋白的表達水平, 從而明確干擾效果。結果表明, Chk2 siRNA序列可顯著降低細胞中Chk2的mRNA與蛋白水平, 而mock siRNA不影響細胞內Chk2水平（圖1）。

2.2 Chk2 siRNA對SUNE-1細胞增殖的影響

將siRNA轉染后的細胞接種到24孔板中, 設置三個復孔, 每天計數(shù)各組細胞數(shù), 至轉染后6 d。結果顯示, Chk2 siRNA對細胞增殖能力無顯著影響（＞0.05; 圖2）。

圖1 Chk2 siRNA干擾效果檢測

Figure 1 Knockdown effect of Chk2 siRNA

A: Chk2 mRNA; B: Chk2蛋白

圖2 Chk2 siRNA對SUNE-1細胞增殖作用的影響

Figure 2 Effect of Chk2 siRNA on proliferation of SUNE-1

2.3 Chk2 siRNA增加SUNE-1細胞對5-FU的敏感性

將siRNA轉染SUNE-1細胞后, 用不同濃度5-FU（0.05, 0.25, 1.25, 6.25 μmol/L）處理細胞后48 h收集細胞, 檢測不同siRNA對5-FU細胞毒性的影響。結果顯示, Chk2干擾可增強5-FU對SUNE-1細胞的細胞毒作用。說明Chk2在5-FU誘導激活的DNA損傷應答中發(fā)揮重要作用, 抑制Chk2可增加SUNE-1細胞對5-FU的敏感性（圖3）。

2.4 Chk2 siRNA增加5-FU引起的SUNE-1細胞凋亡

將siRNA轉染SUNE-1細胞后, 以5-FU處理細胞, 48 h后收集細胞, 進行AnnexinⅤ/PI雙染檢測細胞凋亡水平。結果顯示, Chk2 siRNA單獨處理并不引起SUNE-1細胞發(fā)生細胞凋亡, 但是可以顯著增強5-FU引起的細胞凋亡水平（圖4）。

圖3 Chk2 siRNA顯著增強SUNE-1對5-FU的敏感性

Figure 3 Chk2 siRNA significantly enhanced sensibility of SUNE-1 to 5-FU

與正常細胞比較,*＜0.05,**＜0.01; 與mock siRNA處理細胞比較,#＜0.05,##＜0.01

圖4 Chk2 siRNA對5-FU致SUNE-1細胞凋亡的影響

Figure 4 Effect of Chk2 siRNA on SUNE-1 apoptosis induced by 5-FU

A: 流式細胞儀檢測細胞凋亡; B: 細胞凋亡百分比。與正常細胞比較,*＜0.05,**＜0.01; 與mock siRNA處理細胞比較,#＜0.05,##＜0.01

3 討 論

細胞對DNA損傷的應答主要是通過ATR/ ATM-Chk1/2細胞周期檢驗點通路來調節(jié)[3]。ATM和ATR是周期檢驗點網絡中主要的上游信號傳遞分子, 屬于PI3K類激酶（phosphoinositide 3- kinase- like kinase, PI3K）家族成員?；罨腁TM進一步激活Chk1/2及其下游激酶, 進而導致周期阻滯。作為細胞周期檢驗點中的關鍵激酶, Chk1和Chk2在細胞DNA損傷的應答反應中具有重要作用, 因此抑制其功能有利于提高DNA損傷劑對于細胞的殺傷毒性[7-9]。然而, Chk抑制劑對特定DNA損傷劑是否具有增敏作用與DNA損傷劑類型、腫瘤細胞系等多種因素有關[10-15]。5-FU作為一種抗代謝類抗腫瘤藥, 在多種腫瘤細胞中被證明可激活Chk2, 因此我們選擇5-FU來研究抑制Chk2對其的增敏作用。

本研究中, 我們通過siRNA干擾有效地抑制了Chk2在人鼻咽癌鱗狀上皮細胞癌細胞株SUNE-1中的表達。Chk2干擾并未顯著影響細胞的增殖速度和細胞增殖能力, 亦未導致細胞凋亡, 這與其他成體細胞中的結果相符[16-18], 說明Chk2在細胞正常增殖過程中并不發(fā)揮主要作用, 因此, 對Chk2的抑制性治療不會對正常細胞產生危害, 為這種治療策略提供了支持。而Chk2干擾明顯增加了SUNE-1細胞對5-FU的敏感性, 且該作用與5-FU所致的細胞凋亡誘導抑制有關, 這可能是因為Chk2抑制造成細胞周期檢驗點異常, 使之不能有效修復5-FU造成的DNA損傷, 從而導致細胞對DNA損傷敏感性增強, 這說明, Chk2在5-FU引起的細胞損傷中對細胞起保護作用, 而Chk2可成為鼻咽癌治療中增強5-FU療效的靶點。本研究為以細胞周期檢驗點蛋白為靶點的5-FU抗腫瘤增敏療法提供了依據(jù), 為提高該類化療藥物的療效、減少毒副反應奠定了分子生物學基礎。

[1] Hurley LH. DNA and its associated processes as targets for cancer therapy[J]. Nat Rev Cancer, 2002, 2(3): 188-200.

[2] Kohn KW, Jackman J, O'Connor PM. Cell cycle control and cancer chemotherapy[J]. J Cell Biochem, 1994, 54(4): 440-452.

[3] Hartwell LH, Kastan MB. Cell cycle control and cancer[J]. Science, 1994, 266(5192): 1821-1828.

[4] Kastan MB, Bartek J. Cell-cycle checkpoints and cancer[J]. Nature, 2004, 432(7015): 316-323.

[5] Zhou BB, Elledge SJ. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective[J]. Nature, 2000, 408(6811): 433-439.

[6] 潘 宇, 邵榮光. 靶向細胞周期檢驗點的腫瘤治療[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2008, 33(11): 1397-1399.

[7] Pan Y, Ren KH, He HW,. Knockdown of Chk1 sensitizes human colon carcinoma HCT116 cells in a p53-dependent manner to lidamycin through abrogation of a G2/M checkpoint and induction of apoptosis[J]. Cancer Biol Ther, 2009, 8(16): 1559-1566.

[8] Helleday T, Petermann E, Lundin C,. DNA repair pathways as targets for cancer therapy[J]. Nat Rev Cancer, 2008, 8(3): 193-204.

[9] Ashwell S, Zabludoff S. DNA damage detection and repair pathways--recent advances with inhibitors of checkpoint kinases in cancer therapy[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(13): 4032-4037.

[10] Mukhopadhyay UK, Senderowicz AM, Ferbeyre G. RNA silencing of checkpoint regulators sensitizes p53-defective prostate cancer cells to chemotherapy while sparing normal cells[J]. Cancer Res, 2005, 65(7): 2872-2881.

[11] Flatten K, Dai NT, Vroman BT,. The role of checkpoint kinase 1 in sensitivity to topoisomerase I poisons[J]. J Biol Chem, 2005, 280(14): 14349-14355.

[12] Carrassa L, Broggini M, Erba E,. Chk1, but not Chk2, is involved in the cellular response to DNA damaging agents: differential activity in cells expressing or not p53[J]. Cell Cycle, 2004, 3(9): 1177-1181.

[13] Playle LC, Hicks DJ, Qualtrough D,. Abrogation of the radiation-induced G2 checkpoint by the staurosporine derivative UCN-01 is associated with radiosensitisation in a subset of colorectal tumour cell lines[J]. Br J Cancer, 2002, 87(3): 352-358.

[14] Sugiyama K, Shimizu M, Akiyama T,. UCN-01 selectively enhances mitomycin C cytotoxicity in p53 defective cells which is mediated through S and/or G(2) checkpoint abrogation[J]. Int J Cancer, 2000, 85(5): 703-709.

[15] Karnitz LM, Flatten KS, Wagner JM,. Gemcitabine- induced activation of checkpoint signaling pathways that affect tumor cell survival[J]. Mol Pharmacol, 2005, 68(6): 1636-1644.

[16] Zachos G, Rainey MD, Gillespie DA. Chk1-deficient tumour cells are viable but exhibit multiple checkpoint and survival defects[J]. EMBO J, 2003; 22(3): 713-723.

[17] Chen Z, Xiao Z, Chen J,. Human Chk1 expression is dispensable for somatic cell death and critical for sustaining G2 DNA damage checkpoint[J]. Mol Cancer Ther, 2003, 2(6): 543-548.

[18] Zhang WH, Poh A, Fanous AA,. DNA damage-induced S phase arrest in human breast cancer depends on Chk1, but G2 arrest can occur independently of Chk1, Chk2 or MAPKAPK2[J]. Cell Cycle, 2008, 7(11): 1668-1677.

（編輯: 任開環(huán)）

Enhanced sensitivity of nasopharyngeal carcinoma SUNE-1 cells to 5-FU by Chk2 knockdown

PAN Yu1, CAI Sa2, ZHU Jiening1, LIN Qiuxiong1, YU Xiyong1

(1Research Center of Medical Sciences, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong General Hospital, Guangzhou 510080, China.2Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China)

To investigate the chemosensitization of Chk2 inhibition to 5-FU against nasopharyngeal squamous epithelial cell line SUNE-1.Chk2 siRNA was designed according to the mRNA sequence of Chk2, and its effect was confirmed by RT-PCR and Western blotting in SUNE-1 cells. Cell growth assay was evaluated to determine the impact of Chk2 siRNA on the proliferation ability of SUNE-1 cells and MTT assay was used to determine the chemosensitization of Chk2 siRNA to 5-FU. Finally, apoptotic cells was stained with AnnexinⅤ/PI and examined by flow cytometry.Chk2 siRNA significantly reduced mRNA and protein levels of Chk2 in SUNE-1 cells, which confirmed the knockdown effect of Chk2 siRNA. Cell growth assay showed that Chk2 siRNA did not influence the proliferation of SUNE-1 cells. However, Chk2 knockdown significantly enhanced the cytotoxicity and apoptosis of SUNE-1 cells caused by 5-FU.Chk2 hinders the toxic effect of 5-FU on SUNE-1 cells, which can be enhanced by Chk2 inhibition. Therefore, Chk2 can be proposed as a target to increase the effect of chemotherapeutic agent, such as 5-FU, in clinical treatment onnasopharyngeal carcinoma.

antineoplasitc agents; nasopharyngeal carcinoma; 5-FU; Chk2; RNA interference

(81000835, 81000011)(10451018201004913)

R730.53

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00053

2012-02-14;

2012-03-14

國家自然科學基金(81000835, 81000011); 廣東省自然科學基金(10451018201004913)

余細勇, Tel: 020-83827812, E-mail: yuxycn@hotmail.com