權 琳, 王 可, 杜蕓輝, 王 潔, 呂婷婷, 徐海波, 劉慧榮,

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過氧亞硝基陰離子分解催化劑對衰老大鼠血管舒張功能的保護作用

權 琳1, 王 可1, 杜蕓輝1, 王 潔2, 呂婷婷2, 徐海波1, 劉慧榮1,2

（1首都醫(yī)科大學生理學與病理生理學系, 北京 100069;2山西醫(yī)科大學生理學教研室, 太原 030001）

利用過氧亞硝基陰離子（ONOO-）分解催化劑FeTMPyP探討衰老大鼠血管舒張功能障礙的可能機制。選取雄性SD大鼠, 隨機分為成年組（3～4月,= 8）、衰老組（18～20月,= 8）及給予FeTMPyP的衰老組（= 6）; 制備離體胸主動脈環(huán), 觀察血管舒張功能; 采用免疫組織化學法和Western blot法測定血管組織中可代表ONOO-生成的標記物3-硝基酪氨酸（3-NT）的表達。與成年組大鼠比較, 衰老組大鼠胸主動脈環(huán)對10-9～10-5mol/L累積濃度的內皮依賴性舒張劑乙酰膽堿（ACh）的最大舒張程度顯著下降[（29.74%±8.28%）（69.52%±5.51%）,＜0.001]; 對10-9～10-5mol/L累積濃度的非內皮依賴性舒張劑硝普鈉（SNP）的最大舒張程度也顯著下降[（92.01%±3.19%）（99.26%±1.33%）,＜0.001]。與成年組大鼠比較, 衰老組大鼠血管組織中3-NT蛋白表達增加（＜0.05）。給予FeTMPyP后, 衰老大鼠血管組織中3-NT蛋白表達下降（＜0.01）; 抑制ONOO-的生成后, 衰老大鼠胸主動脈環(huán)對累積濃度ACh的最大舒張程度顯著升高[（65.96%±11.36%）（29.74%±8.28%）,＜0.001], 對累積濃度SNP的最大舒張程度也顯著升高[（98.15%±2.79%）（92.01%±3.19%）,＜0.001]。FeTMPyP改善了衰老大鼠血管舒張功能, 提示ONOO-可能在衰老大鼠血管功能障礙中起重要作用。

衰老; 血管; 血管舒張; 3-硝基酪氨酸; 大鼠

流行病學調查研究顯示, 即使在無其他心血管疾病危險因素的情況下, 衰老本身即可明顯增加心血管疾病發(fā)生的危險, 但其具體發(fā)病機制目前尚未明確。有文獻報道, 血管內皮功能障礙已成為心血管疾病發(fā)生的重要標志之一[1,2]; 而血管內皮年齡依賴性的舒張功能障礙是人和動物血管老化的標志[3,4]。在生理情況下, 血管舒張主要是由一氧化氮（nitric oxide , NO）來發(fā)揮作用的, 然而, 在病理情況下, 體內會產(chǎn)生高濃度的NO, 可與超氧陰離子（superoxide anion, O2-）以彌散限制速率反應生成過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite, ONOO-）[2,5,6]。ONOO-是一種具有很強的氧化和硝基化作用的活性氮簇, 可導致體內許多重要的酶/蛋白功能受損或活性下降, 引起心血管功能障礙[7]。研究發(fā)現(xiàn), 衰老大鼠血管組織中代表ONOO-生成的標記物硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine, 3-NT）含量增加, 然而這一現(xiàn)象并不足以證實ONOO-與衰老血管舒張功能障礙的因果關系。因此, 本實驗通過在體給予衰老大鼠ONOO-的分解催化劑FeTMPyP（一種鐵卟啉類化合物）, 觀察血管舒張功能是否改善, 進而為證實ONOO-與衰老血管舒張功能障礙的關系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

重酒石酸去甲腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司）; 注射用硝普鈉（sodium nitroprusside, SNP, 北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司）; 乙酰膽堿（acetylcholine, ACh, Sigma公司, 美國）; FeTMPyP（C44H36FeN8·5Cl, Cayman Chemical公司, 美國）;抗3-NT單克隆抗體（StressMarq公司, 加拿大）; 小鼠超敏二步法免疫組化檢測試劑、濃縮型DAB試劑盒、馬抗小鼠IgG/生物素標記、辣根過氧化物酶標記鏈親合素（北京中杉金橋）; 抗3-磷酸甘油醛脫氫酶（GADPH）單克隆抗體（上?？党可锕こ逃邢薰荆? Krebs- Henseleit液（mmol/L）: NaCl 118、KCl 4.75、KH2PO41.19、MgSO41.19、NaHCO325、Glucose 10.0、CaCl22.54, pH 7.4; 血管環(huán)張力換能器（Powerlab, Australia）;離體組織器官恒溫灌流裝置和BL-420F＋生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 動物分組

3～4月齡雄性SD成年組大鼠, 18～20月齡雄性SD衰老大鼠[長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務部, 許可證號: SCXK（湘）2009-0012]。衰老大鼠隨機分為衰老組（= 8）及給予ONOO-分解催化劑FeTMPyP的衰老實驗組（= 6）, 給藥方式是衰老大鼠于處死前30 min靜脈注射FeTMPyP（3 mg/kg）[8]。

1.3 血管功能的測定

20%烏拉坦溶液（5 ml/kg）腹腔注射麻醉動物, 剪開胸骨, 迅速取出胸主動脈, 放入預冷且氧飽和的Krebs-Henseleit（K-H）液中, 去除周圍結締組織, 將血管剪成約3～4 mm的血管環(huán), 懸掛固定于與張力換能器相連的恒溫器官浴管中, 浴管中持續(xù)通以95% O2＋5% CO2的混合氣體。調節(jié)最適前負荷至2.0 g,平衡90 min, 期間每15 min更換1次K-H液。待血管環(huán)穩(wěn)定后, 給予10-6mol/L的去甲腎上腺素（norepinephrine, NE）收縮血管, 達峰值后, 以累積給藥的方式給予10-9～10-5mol/L的ACh或SNP來觀察血管的舒張功能。以10-6mol/L去甲腎上腺素（norepinephrine, NE）誘發(fā)最大收縮幅度為100%, 以加入藥物后的血管舒張幅度與NE誘發(fā)最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化。

1.4 血管組織中3-NT的表達

ONOO-極不穩(wěn)定, 很容易降解, 因此無法直接檢測其含量。組織硝基化酪氨酸形成是體內ONOO-形成的印記和標記, 其含量可以直接反應ONOO-的水平[9]。本實驗中采用免疫組織化學法和Western blot法檢測血管組織中3-NT表達。

1.4.1 免疫組織化學法檢測血管組織中3-NT表達 將胸主動脈固定、包埋、切片、脫蠟、抗原修復后, 依次滴加3% H2O2、0.3% Triton X-100和5%胎牛血清, 隨后加入一抗3-NT單克隆抗體（1:1000, 4℃過夜）、小鼠超敏二步法免疫組化檢測試劑, DAB顯色、脫水、透明、封片。陰性對照采用 PBS代替一抗。

1.4.2 Western blot法檢測血管組織中3-NT表達 稱取適當量的血管組織, 加入裂解液, 置冰上剪碎、勻漿、離心10 min（4℃, 10000 r/min）, 提取上清, BCA法檢測蛋白濃度。隨后進行電泳、轉膜、加入3-NT單克隆抗體（1:1000, 4℃過夜）、加入二抗, 最后于暗室進行發(fā)光。以GAPDH作為內參對照。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 衰老大鼠離體胸主動脈環(huán)內皮依賴性和非內皮依賴性舒張功能均明顯下降

給予10-9～10-5mol/L累積濃度的內皮依賴性舒張劑ACh后, 衰老組大鼠胸主動脈環(huán)對ACh的舒張反應與成年組大鼠比較, 差異有統(tǒng)計學意義（＜0.001）, 而且血管最大舒張程度由（69.52%± 5.51%）降低至（29.74%±8.28%）（圖1A）; 給予10-9～10-5mol/L累積濃度的非內皮依賴性舒張劑SNP后, 與成年組相比, 衰老組大鼠血管環(huán)對SNP的舒張反應也明顯下降（＜0.001）, 血管最大舒張程度由（99.26%±1.33%）降低至（92.01%±3.19%）（圖1B）。

2.2 衰老大鼠血管組織中3-NT的表達增加

采用免疫組織化學法檢測血管組織中3-NT的表達, 與成年組大鼠相比, 衰老組血管組織中表達大量陽性3-NT棕黃色顆粒（圖2A）; 同時, Western blot法測定血管組織中3-NT表達, 顯示衰老血管組織中3-NT表達升高, 與成年組相比, 差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05; 圖2B）。

2.3 抑制ONOO-的生成后, 衰老大鼠離體胸主動脈環(huán)內皮依賴性和非內皮依賴性舒張功能均明顯改善

給予ONOO-的分解催化劑FeTMPyP后, 衰老大鼠血管組織中3-NT陽性棕黃色顆粒表達減少（圖2A）, 蛋白表達下降（＜0.01; 圖2B）; 同時, 觀察到FeTMPyP可改善衰老大鼠血管舒張功能。給予FeTMPyP后, 衰老大鼠離體胸主動脈環(huán)對10-9～10-5mol/L累積濃度的ACh的舒張反應顯著改善（＜0.001）, 且血管最大舒張程度由（29.74%±8.28%）升高到（65.96%±11.36%）（圖1A）; 對10-9～10-5mol/L累積濃度的SNP的舒張反應也顯著改善（＜0.001）, 且血管最大舒張程度由（92.01%±3.19%）升高到（98.15%±2.79%）（圖1B）。

圖1　大鼠離體胸主動脈環(huán)對內皮依賴性舒張劑乙酰膽堿(A)和非內皮依賴性舒張劑硝普鈉(B)的反應

Figure 1 Vasodilation responses of isolated thoracic aortic rings to acetylcholine and sodium nitroprusside

A: 對乙酰膽堿的反應; B: 對硝普鈉的反應。與成年組比較,***＜0.001; 與衰老組比較,###＜0.001

圖2 血管組織中3-硝基酪氨酸的表達

Figure 2 Expression of 3-nitrotyrosine (3-NT) in vascular tissues

A: 免疫組織化學（DAB, ×10）; B: Western blot 方法; C: Western blot灰度掃描圖。與成年組比較,*＜0.05; 與衰老組比較,##＜0.01

3 討 論

衰老是心血管疾病發(fā)生的主要危險因素之一,可能因為衰老過程中有血管內皮和平滑肌細胞功能障礙的發(fā)生, 或同時伴有二者之間信號轉導通路的改變[10]。已有文獻報道, 與成年組相比, 衰老組離體血管環(huán)（如胸主動脈、冠狀動脈、腸系膜動脈等）對ACh 反應明顯下降, 對SNP 反應無明顯差異[3,11]。ACh 和SNP 均為血管擴張劑, 不同的是, ACh 須通過內皮細胞分泌的一氧化氮（NO）間接作用于平滑肌才能導致血管的舒張反應, 因此, 由其引起的血管舒張被稱為內皮依賴性舒張, 反應血管內皮舒張功能; SNP 則不依賴內皮, 而作為NO 供體直接作用于血管平滑肌引起舒張, 這種舒張被稱為非內皮依賴性舒張, 反應血管平滑肌舒張功能。本實驗結果顯示, 與成年組相比, 衰老組大鼠離體胸主動脈環(huán)對ACh 反應明顯下降, 這與文獻報道的結果一致;但衰老大鼠血管環(huán)對SNP 舒張反應也明顯下降。這種血管舒張功能下降的機制不清楚, 可能是因NO生物利用度下降, 或衰老大鼠血管平滑肌表型發(fā)生改變, 即由收縮型變?yōu)榉置谛蚚12], 或平滑肌細胞信號轉導通路的改變[10,12], 或ONOO?生成增加導致的毒性作用等[13]。

目前所知最強的內源性血管舒張因子是NO, 它是在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）作用下由左旋精氨酸轉化而來。NOS主要包括原生型NOS（constitutive NOS, cNOS）和誘生型NOS（inducible NOS, iNOS）, cNOS又可分為神經(jīng)原性NOS和內皮細胞NOS。生理情況下, cNOS即可表達, 而iNOS一般不被誘導產(chǎn)生。cNOS促進生成少量NO, 發(fā)揮舒血管生理作用; 病理情況下, iNOS被誘導生成, 催化合成大量NO。體內產(chǎn)生的高濃度NO, 與O2-以彌散限制速率（6.7×109M-1·S-1）反應生成ONOO-[5,6]。ONOO-可快速地穿過膜脂質層, 浸潤細胞, 破壞許多細胞生物分子和結構, 導致細胞內受體和酶功能的鈍化、DNA斷裂等一系列損傷作用。然而, ONOO-極不穩(wěn)定, 可與蛋白質酪氨酸殘基或游離酪氨酸發(fā)生硝化反應生成3-NT, 3-NT被公認為是組織中ONOO-生成的穩(wěn)定生物學標志物[9]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[14], 在衰老大鼠血管組織中, iNOS表達增加; 給予iNOS特異性抑制劑1400w后, iNOS表達下降, 血管舒張功能部分改善。本研究中, 我們進一步觀察到衰老大鼠血管組織中3-NT表達增加, 給予ONOO-分解催化劑FeTMPyP后, 3-NT表達減少, 血管舒張功能明顯改善, 提示ONOO-的增加可能是衰老血管舒張功能障礙的機制之一。

FeTMPyP是一種水溶性的金屬卟啉類ONOO-分解催化劑, 具有低濃度和高效率的特點, 主要通過催化ONOO-轉化為硝酸鹽（＞90%）, 而減輕其毒性作用, 對機體起保護作用。已有報道, FeTMPyP改善糖尿病大鼠神經(jīng)病變和降低氧化硝化反應[15]、減輕順鉑誘導的腎損傷[16]及離體細胞中ONOO-的毒性反應等[17]。本研究中給予FeTMPyP后, 衰老大鼠胸主動脈環(huán)對ACh和SNP舒張反應明顯改善, 證實, ONOO-參與衰老大鼠血管環(huán)內皮依賴性和非內皮依賴性舒張功能障礙。

綜上所述, 衰老大鼠胸主動脈環(huán)對內皮依賴性舒張劑ACh和非內皮依賴性舒張劑SNP反應均下降, 且血管組織中3-NT表達增加; 給予ONOO-的分解催化劑FeTMPyP后, 衰老大鼠血管環(huán)對ACh和SNP舒張反應均明顯改善, 提示ONOO-在衰老血管舒張功能障礙中起重要的作用, 其分解催化劑類物質可為治療與血管功能障礙有關的心血管等疾病提供一種新的方法。

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（編輯: 王雪萍）

Peroxynitrite decomposition catalyst improves vascular dysfunction inaging rats

QUAN Lin1, WANG Ke1, DU Yunhui1, WANG Jie2, LV Tingting2, XU Haibo1, LIU Huirong1,2

(1Department of Physiology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069;2Department of Physiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)

To investigate the possible mechanisms of aging-associated vascular dysfunction by peroxynitrite (ONOO-) decomposition catalyst FeTMPyP.Male Sprague-Dawlew (SD) rats were randomly divided into three groups: adult group (3-4-month-old,=8), aging group (18-20-month-old,=8), and FeTMPyP treatment aging group (=6). The thoracic aorta was isolated for measurement of vascular diastolic function. Immunohistochemistry and Western-blot were performed to determine the expression of 3-nitrotyrosine (3-NT, a marker of ONOO-formation) in thoracic aortic arteries.(1) Comparing with adult group, the maximal vasodilation in aging rats induced by acetylcholine (ACh, an endothelium-dependent vasodilator, 10-9to 10-5mol/L) was significantly decreased from (69.52% ± 5.51%) to (29.74% ± 8.28%) (＜0.001); the maximal vasodilation induced by sodium nitroprusside (SNP, an endothelium-independent vasodilator, 10-9to 10-5mol/L) was also decreased from (99.26% ± 1.33%) to (92.01% ± 3.19%) (＜0.001). (2) The expression of 3-NT in aging vascular tissues was increased (＜0.05) compared with adult group. (3) In aging rats treated with FeTMPyP, the expression of 3-NT was decreased (＜0.01). Moreover, FeTMPyP significantly improved vascular endothelium- dependent and endothelium-independent vasodilations in aging rats. After inhibiting the generation of ONOO-, ACh-induced maximal vasorelaxation was markedly increased [(65.96%±11.36%)(29.74%±8.28%),＜0.001] and SNP-induced maximal vasodilation was also increased [(98.15%±2.79%)(92.01%±3.19%),＜0.001].FeTMPyP can improve vasodilation dysfunction in aging rats, suggesting that ONOO-may play an important role in aging-related vascular dysfunction.

aging; blood vessels; vasodilation; 3-nitrotyrosine; rats

(No. 30973163, 30572084)(No. PHR201106112).

R331.3＋2

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00054

2011-09-01;

2012-01-17

國家自然科學基金項目(No.30973163, 30572084); 北京市屬高等學校人才強教深化計劃“學校創(chuàng)新團隊建設計劃”項目(No. PHR201106112)

劉慧榮, Tel: 010-83911830, E-mail: liuhr2000@126.com