史凱蕾, 朱 毅, 繆應(yīng)新, 郭新貴

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脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T與老年非糖尿病冠心病的相關(guān)性

史凱蕾1*, 朱 毅1, 繆應(yīng)新2, 郭新貴1

（復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院:1心血管內(nèi)科,2中心實驗室, 上海 200040）

探討老年人脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T與老年非糖尿病冠心病的相關(guān)性。選擇2005年11月至2009年12月入住我院心血管內(nèi)科病房, 行冠狀動脈造影、年齡≥65歲的非糖尿病患者688例, 根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果分為冠心病組396例和對照組292例。采用聚合酶鏈式反應(yīng)/連接酶檢測反應(yīng)方法檢測多態(tài)性位點。SNPs＋45T＞G基因表型為突變型GG者發(fā)生冠心病的危險性較TT型者顯著增加（OR = 2.65,＜0.01）; SNPs＋276G＞T基因表型為GG型者發(fā)生冠心病的危險性較TT型者顯著增加（OR = 2.36,＜0.01）; 雜合子GT型者發(fā)生冠心病的危險性也較TT型者顯著增加（OR = 1.66,＜0.05）。logistic回歸分析顯示, SNPs＋45T＞G基因表型為GG型, SNPs＋276G＞T基因表型為GG和GT型是冠心病發(fā)病獨立的危險因素。SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T位點存在連鎖不平衡, 脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G基因表型為突變型GG型者SNPs＋276G＞T基因表型均為GG型, 而SNPs＋276G＞T基因表型為突變型TT型者SNPs＋45T＞G基因表型均為TT型, 即GGGG基因表型和TTTT基因表型, 且SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T位點基因表型為GGGG型者發(fā)生冠心病的危險性顯著高于TTTT型者（OR = 4.77,＜0.01）。在老年非糖尿病者中, 脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G基因表型為GG型者和SNPs＋276G＞T基因表型為GG或GT型者可能是冠心病的易感人群。

脂聯(lián)素; 單核苷酸基因多態(tài)性; 冠心病; 老年人

脂聯(lián)素是脂肪細胞特異分泌的一種蛋白質(zhì),由244個氨基酸構(gòu)成,在人血漿中含量豐富,約占總血漿蛋白質(zhì)的0.01%[1]。實驗證據(jù)顯示脂聯(lián)素與動脈粥樣硬化具有明顯的相關(guān)性,血清脂聯(lián)素水平降低與動脈粥樣硬化損傷的嚴重性密切相關(guān),低脂聯(lián)素血癥是冠心病獨立的危險因素[2,3]。編碼脂聯(lián)素的基因位于染色體3q27,包括3個外顯子和2個內(nèi)含子。全基因組掃描及相關(guān)研究推測該染色體區(qū)域為心血管疾病、糖尿病、代謝綜合征的易感位點[4-6]。正常人脂聯(lián)素基因中存在相當數(shù)量的等位基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）,脂聯(lián)素外顯子2的SNPs＋45T＞G和內(nèi)含子2的SNPs＋276G＞T被證實與糖尿病、代謝綜合征的發(fā)病有關(guān)[7,8],而關(guān)于脂聯(lián)素這兩個位點SNPs與冠心病關(guān)系的研究結(jié)果卻不盡相同。一方面汝穎等[9]研究發(fā)現(xiàn), 脂聯(lián)素基因SNPs＋276G＞T基因型GG＋G/T與TT相比,患冠心病的風(fēng)險比值明顯上升（OR = 2.976）;另一方面Jung等[10]的研究則顯示, 脂聯(lián)素SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T多態(tài)性與冠心病發(fā)病無關(guān)。

目前文獻中尚無關(guān)于65歲以上老年人脂聯(lián)素SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T與冠心病相關(guān)性的報道。本文對老年非糖尿病冠心病患者脂聯(lián)素SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T基因表型分布情況進行了觀察,旨在探討其與冠心病發(fā)病的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 對象

入選對象為2005年11月至2009年12月在我院心血管內(nèi)科住院行冠狀動脈造影,年齡≥65歲的患者,共688例。排除標準:糖尿病、心肌病、瓣膜病、嚴重肝、腎功能不全;各種急慢性感染性疾病、腫瘤患者;6個月內(nèi)有腦卒中史;自身免疫性疾病患者。其中男性507例,女性181例,平均年齡（73.76±6.58）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料采集 由專人負責測量身高、體重、坐位血壓,計算體質(zhì)量指數(shù)（body mass index,BMI）= 體重/身高2（kg/m2）。心血管內(nèi)科專科醫(yī)師于入院當日收集患者既往病史。選擇性冠狀動脈造影檢查使用西門子Axiom 100數(shù)字減影機,由心臟內(nèi)科專業(yè)醫(yī)師操作,選擇常規(guī)投照體位觀察冠狀動脈病變,分別對左主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈及其一級分支病變狹窄程度進行評價。

1.2.2 分組標準 根據(jù)美國心臟病學(xué)會所規(guī)定的冠狀動脈血管圖像記錄分段評價標準,應(yīng)用計算機軟件定量冠脈造影對內(nèi)徑≥2.5 mm的主要冠狀動脈（左主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈）進行測量,有一支主要血管狹窄直徑≥50%判斷為冠心病。根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果,在所有入選病例中,冠心病組為396例,對照組為292例。

1.2.3 脂聯(lián)素基因SNPs檢測 每位研究對象抽取1 ml靜脈血（EDTA抗凝）,采用介質(zhì)純化法提取白細胞DNA（生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,上海）,聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）擴增包含SNPs＋276G＞T多態(tài)位點的脂聯(lián)素DNA片斷,用連接酶檢測反應(yīng)（ligase detection reaction,LDR）檢測PCR產(chǎn)物,從而識別多態(tài)性位點。用生物學(xué)軟件Primer 3設(shè)計引物,上游引物5′-GTCTCTCCTTGGCTGACAGTG-3′;下游引物:5′-AATCATTCAGGTTGCTTATGGTTA-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μl,95℃預(yù)變性15 min;94℃變性30s,60℃退火90 s,72℃延伸30 s,共35個循環(huán);末次72℃延伸10 min,PCR產(chǎn)物長度為400 bp,PCR產(chǎn)物采用3%瓊脂糖凝膠電泳檢驗。根據(jù)LDR探針設(shè)計原則設(shè)計LDR的上下游探針。上游探針5′端采用磷酸化修飾,3′端采用熒光標記（表1）。LDR反應(yīng)體系為10 μl,95℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s, 60℃退火2 min,共35個循環(huán)。LDR產(chǎn)物在Abi Prism 377測序儀下測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析, 計算Hardy- Weinberg平衡以判斷樣本的群體代表性。實驗數(shù)據(jù)中計量資料用均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用檢驗;多組間比較采用ANOVA方差分析;基因型的分布頻率比較用χ檢驗和logistic回歸分析。＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 LDR反應(yīng)探針序列(5′～3′)

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

兩組間一般情況比較見表2,冠心病組和對照組在年齡、性別、BMI、高血壓史、高脂血癥史等方面均衡可比（＞0.05）;冠心病組吸煙者多于對照組（＜0.01）。

表2 各組一般情況比較

注: BMI: 體質(zhì)量指數(shù)。與對照組比較,**＜0.01

2.2 基因表型分析

PCR產(chǎn)物長度為400 bp,包含研究所涉及的SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T兩個位點。PCR擴增產(chǎn)物與LDR探針雜交,在連接酶作用下形成含熒光標記的LDR產(chǎn)物。脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G為純合子TT型時,經(jīng)測序儀測得長度為82bp的片斷;基因表型為雜合子T/G型時,測得82 bp和85 bp的兩個片段;基因表型為純合子GG型,則測得85 bp的片斷。688例研究對象中,TT型為399例,T/G型為244例,GG型為45例,以Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗,基因型分布符合遺傳平衡,其基因頻率分布具群體代表性（χ= 0.86,＞0.05）。

脂聯(lián)素基因SNPs＋276G＞T基因表型為純合子GG型時,經(jīng)測序儀測得長度為88 bp的片段;基因表型為雜合子G/T型時,測得88 bp和91 bp的兩個片段;如為純合子TT型,則測得91 bp的片斷。688例研究對象中,GG型為328例,G/T型為282例,TT型為78例,以Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗,基因型分布符合遺傳平衡,其基因頻率分布具群體代表性（χ= 2.12,＞0.05）。

2.3 冠心病組和對照組脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T基因型比較

脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G,冠心病組396例患者中TT型為227/396（57.4%）,T/G型為134/396（33.8%）,GG型為35/396（8.8%）;對照組292例患者中TT型為172/292（58.9%）,T/G型為110/292（37.7%）,GG型為10/292（3.4%）, 兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。

脂聯(lián)素基因SNPs＋276G＞T,冠心病組396例患者中GG型為208/396（52.5%）,G/T型為155/396（39.1%）,TT型為33/396（8.3%）;對照組292例患者中GG型為120/292（41.1%）,G/T型為127/292（43.5%）,TT型為45/292（15.4%）,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。

2.4 脂聯(lián)素基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)性分析

以分類變量冠心病作為因變量,以脂聯(lián)素SNPs＋45T＞G基因型作為自變量進行風(fēng)險因素分析,SNPs＋45T＞G基因表型為突變型GG者發(fā)生冠心病的危險性較具有TT型者顯著增加（OR = 2.65,95%CI 1.208～5.504;＜0.01）;雜合子TG型者與TT型者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（OR = 0.923,95%CI 0.670～1.272;＞0.05）。等位基因G與T相比冠心病的危險性無明顯增加（＞0.05）。

以分類變量冠心病作為因變量,以脂聯(lián)素SNPs＋276G＞T基因型作為自變量進行風(fēng)險因素分析,SNPs＋276G＞T基因表型為GG型者發(fā)生冠心病的危險性較具有TT型者顯著增加（OR = 2.36,95%CI 1.430～3.906;＜0.01）;雜合子GT型者發(fā)生冠心病的危險性也較具有TT型者顯著增加（OR = 1.66,95%CI 1.003～2.763;＜0.05）。等位基因G與T相比冠心病的危險性顯著增加（＜0.01）。將GG和GT基因型合并統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn),至少攜帶一個G等位基因者患冠心病的危險性仍增高（OR = 2.004,95%CI 1.243～3.230;＜0.01）。

2.5 連鎖不平衡分析

本研究還發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T兩個位點的基因表型存在連鎖不平衡。脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G基因表型為突變型GG型者SNPs＋276G＞T基因表型均為GG型;而SNPs＋276G＞T基因表型為突變型TT型者SNPs＋45T＞G基因表型均為TT型。冠心病組脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T兩個位點的基因表型為GGGG型者較對照組顯著增多,相對于脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T兩個位點基因表型為TTTT型者,脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T兩個位點的基因表型為GGGG型者,發(fā)生冠心病的危險性顯著增高（OR = 4.77,95%CI 2.07～10.99;＜0.01）。

2.6 logistic回歸分析冠心病獨立危險因素

以冠心病為因變量（是= 1,否= 0）,年齡（連續(xù)變量）,性別（男= 1,女= 0）,BMI（連續(xù)變量）,高脂血癥（是= 1,否= 0）,吸煙（是= 1,否= 0）,SNPs＋45T＞G基因表型為GG型（是= 1,否= 0）,SNPs＋276G＞T基因表型為GG型和GT型（是=1,否= 0）為自變量,進行l(wèi)ogistic回歸分析,最后進入模型的變量為吸煙、SNPs＋45T＞G基因表型為GG型、SNPs＋276G＞T基因表型為GG型和GT型,提示SNPs＋45T＞G基因表型為GG型、SNPs＋276G＞T基因表型為GG型和GT型為冠心病獨立的危險因素（表3）。

表3 logistic回歸分析冠心病獨立危險因素

注: 第1步回歸變量: 年齡、性別、BMI、高血壓、高血脂、吸煙、SNP45GG, SNP276GG, SNP276GT。*＜0.05

3 討 論

脂聯(lián)素與胰島素抵抗、2型糖尿病及心血管疾病密切相關(guān)。脂聯(lián)素可以通過抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集、改善胰島素抵抗等發(fā)揮心血管保護作用。脂聯(lián)素基因位于染色體3q27上,全基因組掃描證實, 該區(qū)域存在代謝綜合征和冠心病的易感位點,因而此區(qū)域的基因突變可能與冠心病有相關(guān)性。以往關(guān)于脂聯(lián)素基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)性的研究多集中于普通冠心病或冠心病合并糖尿病人群,因此大多混雜了糖尿病這個冠心病重要的危險因素[11,12]。

冠心病是一個多因素疾病,遺傳因素、環(huán)境因素等共同作用導(dǎo)致疾病的發(fā)生。糖尿病是冠心病重要的易患因素之一,排除糖尿病的作用更有利于分析遺傳因素對老年冠心病的影響。本課題首次對老年非糖尿病者脂聯(lián)素SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T多態(tài)性對冠心病的影響作了研究,結(jié)果顯示,在老年非糖尿病患者中,脂聯(lián)素SNPs＋45T＞G基因表型為突變型GG型者發(fā)生冠心病的危險性高于TT型（OR = 2.65）,提示突變型GG基因表型可能為冠心病易感人群,這個結(jié)果與王珺楠[13]及Sabouri等[14]的研究結(jié)果一致。陸峰等[15]研究發(fā)現(xiàn), 南京地區(qū)非2型糖尿病冠心病患者脂聯(lián)素SNPs＋276G＞T與冠心病發(fā)病相關(guān),GG型可能是冠心病易感基因。在我們的研究中,脂聯(lián)素SNPs＋276G＞T基因表型為GG型者發(fā)生冠心病的危險性高于突變型TT型（OR = 2.36）;基因表型為GT型者雖發(fā)生冠心病的危險性低于GG型,但仍高于TT型（OR = 1.66）;攜帶至少一個G等位基因（GG或GT型）者冠心病的危險性高于TT型者（OR = 2.00）,提示突變型TT型可能為具有保護作用的冠心病基因表型,該結(jié)果與陸峰等[15]的報道相符。Logistic回歸分析顯示,在考慮了年齡、性別、高血壓、高脂血癥、吸煙等冠心病常見的易患因素后,SNPs＋45T＞G 基因表型為GG型、SNPs＋276G＞T基因表型為GG型和GT型仍然是冠心病發(fā)病獨立的危險因素。由此可見,在老年非糖尿病患者中,脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T與冠心病的發(fā)生存在一定的相關(guān)性。

我們的研究還發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T存在連鎖不平衡,脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G基因表型為突變型GG型者SNPs＋276G＞T基因表型均為GG型;而SNPs＋276G＞T基因表型為突變型TT型者SNPs＋45T＞G基因表型均為TT型。進一步統(tǒng)計分析顯示,冠心病組脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T兩個位點的基因表型為GGGG型者發(fā)生冠心病的危險性顯著高于TTTT型者（OR = 4.77,95%CI 2.07～10.99）提示脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T兩個位點的基因表型為GGGG型者可能是冠心病的易感人群。

綜上所述,在老年非糖尿病者中,脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G基因表型為GG型者,SNPs＋276G＞T基因表型為GG或GT型者可能是冠心病的易感人群。脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T影響冠心病發(fā)病的機制尚不清楚,可能與脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T所致脂聯(lián)素基因功能變異影響了脂聯(lián)素mRNA表達有關(guān)[16],也可能與脂聯(lián)素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T影響了血脂代謝有關(guān)[17],從而影響了冠心病的易感性,這些想法有待今后更進一步的研究證實。

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（編輯: 任開環(huán)）

Two single nucleotide polymorphisms (＋45T＞G and＋276G＞T) of adiponectin gene and coronary artery diseases in the elderly without diabetes

SHI Kailei1*, ZHU Yi1, MIAO Yingxin2, GUO Xingui1

(1Department of Cardiology,2Central Laboratory, Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China)

To investigate the association between two single nucleotide polymorphisms (SNPs＋45T＞G and SNPs＋276G＞T) of adiponectin gene and coronary artery diseases(CAD) in elderly patients without diabetes.Coronary angiography were performed in 688 subjects≥65 years without diabetes who were admitted to department of cardiology during November 2005 to December 2009. The subjects were divided into CAD group and control group according to coronary angiography. Genotype of two SNPs was measured by polymerase chain reaction/ligase detection reaction (PCR/LDR) assay.At＋45position, the risk rate of CAD in GG genotype was significantly increased compared with that in TT genotype(OR = 2.65,＜0.01). At＋276position, the risk rate of CAD in GG or GT genotype was significantly higher than that in TT genotype(GG: OR = 2.36,＜0.01; GT: OR =1.66,＜0.05). Logistic regression analysis showed that GG genotype at SNPs＋45T＞G, GG genotype and GT genotype at SNPs＋276G＞T were independent risk factors of CAD. Furthermore, adiponectin gene SNPs＋45T＞G and SNPs＋276G＞T displayed strong linkage disequilibrium. GG genotype was shown at SNPs＋276G＞T when SNPs＋45T＞G genotype was GG and TT genotype was shown at SNPs＋45T＞G when SNPs＋276G＞T genotype was TT, that is GGGG and TTTT genotypes. Homozygous GGGG subjects showed a significantly higher risk of CAD(OR = 4.77,＜0.01) than homozygous TTTT subjects.In non-diabetic elderly subjects, those with GG genotype at SNPs＋45T＞G, GG genotype and GT genotype at SNPs＋276G＞T are the susceptible population of CAD.

adiponectin; single nucleoside polymorphism; coronary artery disease; elderly

R541.4

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00047

2011-03-09;

2011-08-06

史凱蕾, Tel: 021-62483180-63610, E-mail: kelly953142@hotmail.com