董長(zhǎng)征董秀芳孔艷莉陳堯趙磊李哲趙文清李文玲

神經(jīng)肽Y對(duì)海馬神經(jīng)元“癲癇樣”動(dòng)作電位的影響

董長(zhǎng)征*董秀芳△孔艷莉*陳堯*趙磊*李哲*趙文清*李文玲*

【摘要】目的 探討神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）對(duì)海馬神經(jīng)元“癲癇樣”動(dòng)作電位的影響。方法 用無(wú)鎂細(xì)胞外液處理原代培養(yǎng)12 d的海馬神經(jīng)元3 h，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元癲癇樣放電，建立海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型；用全細(xì)胞膜片鉗電流鉗模式檢測(cè)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢唬謩e給予0.1 μmol／L和1 μmol／L NPY各1 μL，給藥時(shí)間 10 s，觀察其對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率及波幅的影響。結(jié)果 無(wú)鎂細(xì)胞外液處理神經(jīng)元3 h，可以形成穩(wěn)定的海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型，頻率16～23 Hz，波幅75～96 mV。模型組神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率為（18.00±2.32）Hz，而0.1 μmol／L和1 μmol／L NPY組分別為（4.75±1.04）Hz和（1.50±0.75）Hz。與模型組相比較，兩種濃度NPY組均降低了動(dòng)作電位發(fā)放的頻率 （P＜0.05）。模型組神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢徊ǚ鶠?（82.25±5.17）mV， 而0.1 μmol／L和1μmol／L NPY組分別為（49.75±2.49）mV和（40.00±2.20）mV。與模型組相比較，兩種濃度NPY組均降低了動(dòng)作電位發(fā)放的波幅（P＜0.05）。兩種濃度NPY之間相比較，也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。1 μmol／L NPY明顯抑制了動(dòng)作電位發(fā)放的頻率和波幅。結(jié)論 NPY能夠抑制無(wú)鎂細(xì)胞外液誘發(fā)的神經(jīng)元癲癇樣電活動(dòng)，為應(yīng)用NPY抑制癲癇發(fā)作提供了細(xì)胞電生理學(xué)證據(jù)。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)肽Y 癲癇 神經(jīng)元 動(dòng)作電位 全細(xì)胞膜片鉗記錄

神經(jīng)肽Y（neuropeptide，NPY），全名神經(jīng)肽酪氨酸，由36個(gè)氨基酸組成的多肽。Tatemoto等［1］于1982年首先在豬腦中提取。作為廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，NPY被認(rèn)為具有抗癲癇發(fā)作的作用。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)利用腺相關(guān)病毒載體將NPY基因轉(zhuǎn)移至腦內(nèi)，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染的方法可以減輕紅藻氨酸致癇大鼠的發(fā)作程度［2］。神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢皇侵干窠?jīng)元受到外界刺激時(shí)在靜息電位的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的可擴(kuò)布的電位變化過(guò)程，反映了機(jī)體神經(jīng)元的興奮性，與癲癇發(fā)病的生理機(jī)制密切相關(guān)。目前為止，NPY抑制癲癇發(fā)作的細(xì)胞分子學(xué)機(jī)制仍不十分清楚。本研究以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型為基礎(chǔ)，研究NPY對(duì)海馬神經(jīng)元癲癇動(dòng)作電位的影響，探討NPY抑制癲癇發(fā)作的細(xì)胞分子學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 新生24 h Wistar大鼠15只，由英國(guó)利茲大學(xué)生物系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑和儀器：Neurobasal TM，胎牛血清（FBS），胰蛋白酶（Trypsin），L-多聚賴氨酸，N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸均購(gòu)自GIBCO公司，氯化鎂（MgC12·6H2O）分析純 （Fisher Scientific，UK），膜片鉗放大器（Axon patch 200B，USA），模／數(shù)轉(zhuǎn)換器 （Digidata 1320A 16-bit Aequisition System， USA），灌流控制系統(tǒng)BPS-8（Axon， USA）， 倒置顯微鏡Olympus CK2（Olympus，Japan）。

1.2 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng) 在解剖顯微鏡輔助下，分離新生24 h Wistar大鼠雙側(cè)海馬組織，根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］的方法，進(jìn)行原代神經(jīng)元培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)調(diào)整為2×105cells／mL，然后將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，在CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。自第6 d起，用加入10 μmol／L阿糖胞苷（Ara-C）抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)12 d的細(xì)胞用于后續(xù)膜片鉗試驗(yàn)。

1.3 神經(jīng)元癲癇樣放電模型的建立 將培養(yǎng)12 d的海馬神經(jīng)元，用無(wú)鎂（Mg2＋free）細(xì)胞外液處理3 h，用于后續(xù)膜片鉗試驗(yàn)。采用EPC-10膜片鉗系統(tǒng)進(jìn)行全細(xì)胞模式的電流鉗記錄神經(jīng)元的動(dòng)作電位，若出現(xiàn)自發(fā)的穩(wěn)定的癲癇樣異常放電形式，說(shuō)明造模成功。正常細(xì)胞外液組成成分：NaCl 147 mmol／L，HEPES 10 mmol／L，Glucose 13 mmol／L，KCl 2 mmol／L，CaCl22 mmol／L，MgCl22 mmol／L；用5 mmol／L NaOH調(diào)節(jié) pH至 7.3，調(diào)整滲透壓為280～320 mOsm／L。無(wú)鎂細(xì)胞外液組成成分：NaCl 147 mmol／L，HEPES 10 mmol／L，Glucose 13 mmol／L，KC1 2 mmol／L，CaCl22 mmol／L；用5 mmol／L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.3，調(diào)整滲透壓為280～320 mOsm／L。培養(yǎng)的神經(jīng)元被分為3組：模型組（Mg2＋free組），NPY（0.1 μmol／L）干預(yù)組，NPY（1 μmol／L）干預(yù)組。模型組只用無(wú)鎂細(xì)胞外液處理3 h；NPY（0.1 μmol／L）干預(yù)組， 在神經(jīng)元癲癇樣放電模型建立成功后，給予0.1 μmol／L NPY；NPY（1 μmol／L）干預(yù)組，在神經(jīng)元癲癇樣放電模型建立成功后，給予1 μmol／L NPY。

1.4 全細(xì)胞膜片鉗模式記錄海馬神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?/p>

1.4.1 記錄動(dòng)作電位的電極內(nèi)液 記錄動(dòng)作電位的電極內(nèi)液組成成分：KCl 147 mmol／L，MgC122 mmol／L，HEPES 10 mmol／L，EGTA 1 mmol／L；用3 mmmol／L KOH調(diào)節(jié)pH至7.3，調(diào)整滲透壓為280～320 mOsm／L。實(shí)驗(yàn)前用孔徑0.22 μm的一次性針頭濾器過(guò)濾滅菌。

1.4.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄模式 選擇美國(guó)WPI公司生產(chǎn)的電導(dǎo)率高且噪聲低的有芯膜片鉗玻璃管，用PP-830型電極拉制儀（Electrode Puller）分兩步法拉制而成，入液的電阻值為6～8 MΩ。在微操縱器輔助下，將微電極吸附在神經(jīng)元細(xì)胞膜上，形成高阻封接后，負(fù)壓破膜，形成細(xì)胞內(nèi)液與電極內(nèi)液相通的全細(xì)胞記錄模式。實(shí)驗(yàn)在室溫（23℃～25℃）條件下進(jìn)行。

1.4.3 電流鉗模式下記錄海馬神經(jīng)元的動(dòng)作電位

設(shè)定參數(shù)：記錄模式為C-Clamp，Gain 2 mv／PA，C-fast 7.86 pF， C-Slow 50.00 pF， Amplitude 5.0 mV，length 5.0 ms，Imembrane 0 pA。先檢測(cè)無(wú)鎂細(xì)胞外液處理后神經(jīng)元的動(dòng)作電位，通過(guò)灌流給藥系統(tǒng)分別給予0.1 μmol／L和1 μmol／L NPY干預(yù)10 s， 然后再次記錄神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏念l率和波幅，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由pClamp 9.0軟件采樣系統(tǒng)獲得，直接進(jìn)入Clamfit 9.0軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量、分析、作圖。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS 8.0進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，采用方差分析及q檢驗(yàn)，α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué) 體外培養(yǎng)神經(jīng)元第12 d的海馬神經(jīng)元在倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)：細(xì)胞周圍有光暈，胞體略突出飽滿、折光性良好，細(xì)胞突起長(zhǎng)而相互連接，彼此間廣泛突觸聯(lián)系形成（圖1）。選取形態(tài)一致的多角形，胞體飽滿，周圍帶光暈發(fā)育良好神經(jīng)元用于后續(xù)膜片鉗試驗(yàn)。

2.2 海馬神經(jīng)元無(wú)鎂細(xì)胞外液處理前后動(dòng)作電位的變化 在全細(xì)胞電流鉗記錄模式下操作，體外培養(yǎng)正常海馬神經(jīng)元可見(jiàn)自發(fā)性興奮性突觸后電位，偶有動(dòng)作電位發(fā)放，見(jiàn)圖2；無(wú)鎂細(xì)胞外液處理神經(jīng)元3 h后，可檢測(cè)到頻發(fā)的動(dòng)作電位發(fā)放，頻率16～23Hz，波幅75～96m V，見(jiàn)圖3。

2.3 NPY對(duì)海馬癲癇樣神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏挠绊懭?xì)胞電流鉗記錄結(jié)果顯示：模型組神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率為（18.00±2.32）Hz，而0.1μmol／L和1μmol／L NPY組分別為（4.75±1.04）Hz和（1.50± 0.75）Hz，與模型組相比較，兩種濃度NPY組均降低了動(dòng)作電位發(fā)放的頻率（q分別為 3.98、4.25，P＜0.05）。模型組神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢徊ǚ鶠椋?2.25 ±5.17）mV，而0.1 μmol／L和1 μmol／L NPY組分別為（49.75±2.49）mV和（40.00±2.20）mV，與模型組相比較，兩種濃度NPY組均降低了動(dòng)作電位發(fā)放的波幅 （q分別為3.45、3.86，P＜0.05）。0.1 μmol／L NPY給藥后動(dòng)作電位的頻率和幅度降低的程度小于1 μmol／L NPY組神經(jīng)元，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（q分別為3.52、3.41，P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖4、5，表1。

表1 各組海馬神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率和波幅（±s）

表1 各組海馬神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率和波幅（±s）

1）與模型組相比，經(jīng)q檢驗(yàn)，P＜0.052）與NPY 0.1 μmol／L組相比，經(jīng)q檢驗(yàn)，P＜0.05

組別模型組NPY 0.1 μmol／L組NPY 1 μmol／L組n888頻率（Hz）18.00±2.32 4.75±1.041）1.50±0.751），2）波幅（mV）82.25±5.17 49.75±2.491）40.00±2.201），2）

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道去除細(xì)胞外的 Mg2＋［4］或通過(guò)用印防己苦毒素（picrotoxin）封閉GABA受體［5］從而誘發(fā)出神經(jīng)元急性發(fā)作間期放電 （Interictal bursting）。Mg2＋在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常電生理活動(dòng)和神經(jīng)元的興奮性具有重要作用，它能夠阻滯鈣離子細(xì)胞內(nèi)流，減少細(xì)胞損傷；還能拮抗如谷氨酸、天冬氨酸等興奮性氨基酸的作用，抑制細(xì)胞去極化；Mg2＋還參與Na＋-K＋-ATP酶的形成，維護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性而阻止癲癇的發(fā)作。因此，移除細(xì)胞生存環(huán)境的Mg2＋，可以誘發(fā)神經(jīng)元的高興奮性狀態(tài)，模擬神經(jīng)元異常放電。Sombati等研究提示無(wú)鎂誘發(fā)的神經(jīng)元出現(xiàn)自發(fā)性反復(fù)性發(fā)放的動(dòng)作電位與臨床癲癇發(fā)作時(shí)的電生理活動(dòng)極為類似，抗癲癇藥物如苯妥英鈉能抑制這類動(dòng)作電位的發(fā)生［6］。本研究根據(jù)上述鎂離子的生理特性，移除細(xì)胞外液鎂離子來(lái)模擬“癲癇微環(huán)境”，誘導(dǎo)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元癲癇樣放電。結(jié)果顯示經(jīng)無(wú)鎂細(xì)胞外液處理3 h后，神經(jīng)元都出現(xiàn)頻發(fā)的高波幅動(dòng)作電位發(fā)放，證實(shí)了此癲癇神經(jīng)元放電模型的可靠性，適合用于膜片鉗電生理檢測(cè)。

圖1 培養(yǎng)12 d海馬神經(jīng)元（×400），bar＝30 μm

圖2 正常海馬神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?/p>

圖3 無(wú)鎂細(xì)胞外液處理3 h后海馬神經(jīng)元的動(dòng)作電位

圖4 0.1 μmol／L NPY給藥后海馬神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?/p>

圖5 1 μmol／L NPY給藥后海馬神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?/p>

良好的神經(jīng)元活性是神經(jīng)電生理實(shí)驗(yàn)的前提基礎(chǔ)。我們采用原代培養(yǎng)12d的海馬神經(jīng)元進(jìn)行電生理研究，因?yàn)榇藭r(shí)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元貼壁后形成許多突起，彼此之間形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，表明培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元在體外仍能形成廣泛的突觸聯(lián)系，具備突觸間生物信息傳遞的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，能很好模擬在體神經(jīng)元的生理狀態(tài)，為神經(jīng)元細(xì)胞分子水平的研究提高良好基礎(chǔ)。

在體癲癇模型證實(shí)NPY具有較確切的抗驚厥作用。大鼠海馬組織中GABA受體被印防己苦毒素（picrotoxin）阻斷后，將NPY注射入被印防己苦毒素誘發(fā)的大鼠模型腦海馬CA1區(qū)可以抑制動(dòng)物癲癇發(fā)作［7］。在紅藻氨酸（KA）誘發(fā)癲癇模型中將NPY注入到側(cè)腦室能有效抑制運(yùn)動(dòng)性癲癇的發(fā)作，并能夠大幅度縮短在海馬齒狀回和CA3區(qū)記錄到的由紅藻酸誘發(fā)的發(fā)作期癲癇異常腦電［8］。癲癇的本質(zhì)是大腦神經(jīng)元的異常超同步化放電，那么，NPY能否對(duì)對(duì)海馬神經(jīng)元癲癇樣放電產(chǎn)生抑制作用，是本研究的關(guān)鍵所在。2011年Stjepana Kovac報(bào)道：1滋mol／L NPY可以降低大鼠海馬腦片雙脈沖刺激引起神經(jīng)元癲癇樣放電的波幅和頻率，而對(duì)鼠腦額葉皮層放電無(wú)影響［9］。上述研究應(yīng)用腦片作為觀察對(duì)象，而對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的影響并未涉及。本實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元作為研究對(duì)象，同樣選擇1滋mol／LNPY進(jìn)行研究，為了進(jìn)一步了解不同濃度NPY對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，選擇0.1滋mol／L NPY進(jìn)行對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果顯示：兩種濃度的NPY均能夠抑制癲癇樣海馬神經(jīng)元的動(dòng)作電位發(fā)放，與給藥前相比能夠降低其動(dòng)作電位的頻率和幅度，發(fā)揮抑制神經(jīng)元異常放電的作用。并且，NPY抑制作用還具有濃度依賴性，在一定范圍內(nèi)，濃度越高抑制作用越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)1滋mol／L NPY對(duì)無(wú)鎂誘發(fā)的高波幅動(dòng)作電位的抑制率要比0.1滋mol／L NPY要高，頻率降低也更多，但是在目前濃度下并沒(méi)有徹底抑制住動(dòng)作電位的發(fā)放?？赡芘c給藥的濃度和持續(xù)時(shí)間均有關(guān)系。實(shí)驗(yàn)不足之處在于僅僅觀察了兩種濃度NPY對(duì)神經(jīng)元放電的影響，NPY的有效作用范圍有待進(jìn)一步確定細(xì)化。總之，本研究初步結(jié)果從細(xì)胞電生理水平證實(shí)了NPY具有抑制海馬神經(jīng)元癲癇樣放電的特性，為臨床應(yīng)用NPY進(jìn)行抗癲癇治療提供了更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

致謝：衷心感謝英國(guó)利茲大學(xué)江林華教授對(duì)本課題在膜片鉗記錄方面給予的技術(shù)指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)

［1］Tatemoto K.Neuropeptide Y：complete amino acid sequence of the brain peptide［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1982，79（18）：5485－5489.

［2］ 董長(zhǎng)征，趙文清，李文玲，等.重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)人源性神經(jīng)肽Y基因轉(zhuǎn)染對(duì)紅藻氨酸致癇大鼠行為及腦電圖的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（19）：2140－2142.

［3］Deshpande LS，Nagarkatti N，Ziobro JM，et al.Carisbamate prevents the development and expression of spontaneous recurrent epileptiform discharges and is neuroprotective in cultured hippocampal neurons［J］.Epilepsia，2008，49（10）：1795－1802.

［4］Bijak M.Inhibitory effect of neuropeptide y on epileptiform activity in the frontal cortex and hippocampus in vitro［J］.Pol J Pharmacol，1995，47（5）：461－463.

［5］Klapstein GJ，Colmers WF.Neuropeptide Y suppresses epileptiform activity in rat hippocampus in vitro［J］.J Neurophysiol，1997，78（3）：1651－1661.

［6］Carter DS，Deshpande LS，Rafiq A，et al.Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampalentorhinal cortical slices prepared from chronic epileptic animals［J］.Seizure，2011，20（3）：218－224.

［7］S?rensen AT，Kanter-Schlifke I，Lin EJ，et al.Activity-dependent volume transmission by transgene NPY attenuates glutamate release and LTP in the subiculum ［J］.Mol Cell Neurosci，2008，39（2）：229－237.

［8］Kuruba R，Hattiangady B，Parihar VK，et al.Differential susceptibility of interneurons expressing neuropeptide Y or parvalbumin in the aged hippocampus to acute seizure activity［J］.PLoS One，2011，6（9）：e24493.

［9］Kovac S，Megalogeni M，Walker M.In vitro effects of neuropeptide Y in rat neocortical and hippocampal tissue ［J］.Neurosci Lett，2011，492（1）：43－46.

（責(zé)任編輯：甘章平）

* 河北省人民醫(yī)院功能神經(jīng)外科（石家莊 050051）

△ 邢臺(tái)市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

【中圖分類號(hào)】R742.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

收稿日期：（2012－05－26）

doi：10.3969／j.issn.1002－0152.2012.08.006

通訊作者（E-mail：liwelling＠163.com）

The expression of neuropeptide Y on action potential in hippocampal epileptic neurons.

DONGChangzheng，DONG Xiufang，KONG Yanli，CHEN Yao，ZHAO Lei，LI Zhe，ZHAO Wenqing，LIN Wenling.Department of Functional Neurosurgery，Hebei General Hospital，No.348 Heping West Road，Shijiazhuang 050051，China.Tel：0311－85989935.

【Abstract】Objective To investigate the effects of NPY on action potential of the hippocampal epileptic neurons in rats.Methods E12 rat primary hippocampal neurons were exposed to magnesium-free solution for 3 h to establish the model of＂epileptic neuron.Whole cell current clamp was used to detect action potentials of the hippocampal epileptic neurons.The frequency and amplitude of neuronal action potential were recorded following treatment with 0.1 μM and 1 μM NPY for 10 s.Results A stable model of epileptiform discharges at frequency 16～23 Hz and amplitude 75～96 mV was successfully created by exposure of the hippocampal neurons to magnesium-free extracellular fluid for 3 h.The frequency of action potential was 18.00±2.32 Hz in the model group，4.75±1.04 Hz in the 0.1μmol／L NPY group and 1.50±0.75 Hz in the 1μmol／L NPY group， respectively.Compared with the model group，the frequency of action potential was significantly decreased in both NPY groups（P＜0.05）.The amplitude of action potential in the model group was 82.25±5.17 mV in the model group， 49.75±2.49 mV in the 0.1 μmol／L NPY group and 40.00±2.20 mV in the 1 μmol／L NPY group，respectively.Compared with the model group，the amplitude of action potential was significantly decreased in both NPY groups（P＜0.05）.The inhibitory effects on the frequency and amplitude of action potential were more pronounced in 1 μmol／L NPY group than in 0.1 μmol／L NPY group（P＜0.05）.Conclusion NPY can inhibit neuronal epileptiform activity induced by magnesium-free extracellular solution，which provides evidence of cell electrophysiology for NPY application in treatment of seizures.

【Key words】Neuropeptide Y Epilepsy Neuron Action Potential Whole cell patch clamp recording