賴前成，鄧永花，萬居易，伍長學(xué)，王 波，廖 斌

(1瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州646000;2成都市第二人民醫(yī)院)

急性腎功能衰竭(AKI)是心臟手術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一，體外循環(huán)是目前心臟外科心內(nèi)直視手術(shù)不可避免的復(fù)雜的病理生理過程，復(fù)雜的管道系統(tǒng)、體外循環(huán)轉(zhuǎn)機時間、灌注流量和壓力、灌流模式等多種因素可導(dǎo)致患者術(shù)后發(fā)生腎功能損傷［1］。動物實驗或者已有的缺氧復(fù)氧細胞培養(yǎng)模型均無法真實模擬這種復(fù)雜的環(huán)境。為此，本研究2009年12月～2010年12月通過改良細胞培養(yǎng)模型，采用體外循環(huán)再灌注血進行人近曲腎小管上皮細胞(HK-2)缺血再灌注損傷研究，并初步分析可能的分子機理，為進一步研究防治體外循環(huán)后腎小管細胞損傷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人HK-2引自ATCC(American Type Culture Collection);DMEM(GIBCO);胰酶(OXODI);胎牛血清(成都哈里公司);Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒(北京中杉金橋公司); SP-9000免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋公司);多聚賴氨酸，DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司);其余試劑均為市售分析純。實驗在我院中心實驗室實施。

1.2 方法

1.2.1 HK-2細胞株的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代 從液氮罐中取出凍存的HK-2細胞投入37℃的溫水中，搖動使其盡快解凍。吸出細胞懸液并滴加10倍體積的質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清液后再重復(fù)洗滌1次。用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細胞懸液稀釋混勻，接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，37℃下5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置12 h，換液除去未貼壁細胞后至細胞長滿成片 80%以上。用濃度為0.25%的胰蛋白酶消化，傳代。

1.2.2 正常人體外循環(huán)再灌注血清的制備 ①隨機采集5例健康志愿者外周血約5 mL，立即在4℃離心機1 500 r/min離心15 min，收集上清，－20℃保存?zhèn)溆谩＂陔S機選取我科5例體外循環(huán)手術(shù)主動脈阻斷時間在60 min以上患者，于開放主動脈1 h后采集患者外周血，立即在4℃離心機1 500 r/min離心15 min，收集上清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 腎小管上皮細胞缺血再灌注模型的建立①培養(yǎng)腎小管上皮細胞的缺血模擬:100%N2飽和無糖無機鹽緩沖液40 min，吸棄6孔板及培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞培養(yǎng)基，用無糖無機鹽緩沖液沖洗，加入100%N2飽和無糖無機鹽緩沖液，置95%N2+5% CO2環(huán)境培養(yǎng)2 h。②培養(yǎng)腎小管上皮細胞的再灌注模擬及分組:吸棄6孔板及培養(yǎng)瓶內(nèi)無糖無機鹽緩沖液后，實驗組加入含10%體外循環(huán)再灌注血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，置95%O2+5%CO2環(huán)境培養(yǎng)4 h。對照組以正常人血清代替再灌注血清，空白組不含血清。處理后的6孔板內(nèi)的腎小管上皮細胞用于免疫細胞化學(xué)法(ICC)檢測。培養(yǎng)瓶內(nèi)的腎小管上皮細胞消化離心洗滌后用于流式細胞儀測定細胞凋亡。

1.2.4 細胞凋亡檢測分析 Anexin V/PI染色:胰酶消化細胞，PBS清洗2次，加入適量的熒光標記的Annexin V試劑和PI，混勻后避光室溫下孵育15 min，孵育后加入400 μL染色緩沖液，立即上流式細胞儀分析并記錄結(jié)果。

1.2.5 Caspase-3蛋白表達檢測 按試劑盒說明書操作，采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白(Streptavidin/Peroxidase，SP)染色的免疫組化檢測Caspase-3蛋白表達。

1.2.6 圖像分析及統(tǒng)計學(xué)方法 圖像分析采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計積分光密度(IOD)值。實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，顯著性檢驗應(yīng)用單因素方差分析在SPSS13.0統(tǒng)計軟件包完成。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞凋亡檢測 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，體外循環(huán)血清處理后，腎小管上皮細胞出現(xiàn)了凋亡，實驗組凋亡率(38.96% ±9.70%)高于對照組(29.83%±8.76%)和空白組(28.76%±7.38%)，P＜0.05。對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 Caspase-3免疫組化檢測 實驗組Caspase-3蛋白的IOD值(99.87±20.38)高于對照組(63.57 ±19.83)及空白組(60.58±15.74)，P＜0.05;對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見插頁Ⅰ圖9。

3 討論

體外循環(huán)心臟手術(shù)后AKI的發(fā)生率為20%～30%，其腎損害輕重不一［2］。動物實驗證實體外循環(huán)并發(fā)AKI主要原因是腎小管損傷［3］，其致病因素較復(fù)雜，包括缺血再灌注損傷及全身炎癥介質(zhì)，常常是綜合性因素所致［4］。Turkmen等［5］通過動物實驗缺血再灌注損傷模擬體外循環(huán)對腎小管細胞損傷作用，觀察到腎小管細胞的壞死、凋亡等變化。也有通過腎小管細胞缺氧復(fù)氧培養(yǎng)來研究腎小管細胞的損傷作用［6］。然而，體外循環(huán)不僅僅是腎臟在體外循環(huán)時受到缺血再灌注損傷，還包括全身多個器官，多種炎癥介質(zhì)在開放升主動脈后參與對腎小管細胞的損傷作用［4］，但目前全面真實的模擬體外循環(huán)手術(shù)后對人近端腎小管上皮細胞損傷的研究還較少。為此本實驗采用心臟體外循環(huán)手術(shù)后血清為研究對象，能較全面真實模擬上述因素對人腎小管的損傷作用。

已有實驗證據(jù)支持凋亡在AKI中的致病作用，而且認為HK-2細胞對凋亡高度敏感，對整個器官衰竭具有重要作用［7］。本實驗通過AnnexinV-FTTC/PI標記流式細胞分析法分析了各組腎小管細胞凋亡早期細胞膜的重排，從而可敏感發(fā)現(xiàn)體外循環(huán)后對腎小管細胞的早期損害。實驗組較對照組、空白組凋亡率明顯增高，說明體外循環(huán)血清對人腎小管上皮有致凋亡作用。隨著對在AKI中腎細胞死亡機制的認識，將產(chǎn)生新的治療靶點［7］。

Caspase-3是凋亡執(zhí)行的重要效應(yīng)分子，是凋亡發(fā)生的關(guān)鍵效應(yīng)酶。其表達的增加、激活是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是凋亡啟動過程中的早期事件，是參與調(diào)節(jié)和執(zhí)行細胞凋亡最重要的蛋白酶之一［8］。細胞凋亡的主要細胞信號通路有Caspase依賴的通路和非 Caspase依賴的通路［9］。本研究實驗組較對照組及空白組Caspase-3蛋白表達明顯增高，這可能激活了依賴Caspase凋亡信號通路，致人腎小管上皮細胞凋亡。

本實驗較真實的模擬了體外循環(huán)后各種致病因素，采用人腎小管細胞作為研究對象，直接觀察到體外循環(huán)術(shù)后對人腎小管細胞的損傷作用。從而在細胞水平為研究保護術(shù)后腎臟損害提供了一種較真實可信的方法。

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