文 / 李依璇 劉顯庭 張 昊 郭慧媛 任發(fā)政 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

圖1 酪蛋白凝膠形成過(guò)程中存在的4 種重排形式

凝乳是干酪生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，凝乳的好壞直接影響到干酪的品質(zhì)，因此有關(guān)凝乳的研究一直是乳制品加工研究的熱點(diǎn)。目前，在部分酸凝干酪中，如農(nóng)家干酪、夸克干酪的生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)加入少量的凝乳酶以促進(jìn)凝乳，這種凝乳方式為酸-酶共促型凝乳。盡管酸-酶共促凝乳對(duì)新鮮干酪的生產(chǎn)極其重要，但有關(guān)酸-酶共促作用的研究直到近些年才有所報(bào)道。本文在概述酶凝、酸凝的基礎(chǔ)之上，對(duì)酸-酶共促凝乳的性質(zhì)及影響等研究進(jìn)行了論述，以期明確酸及凝乳酶在促進(jìn)凝膠形成過(guò)程中的作用。

1 酶凝乳及酸凝乳概述

酪蛋白是形成凝乳的主要成分，在自然狀態(tài)下，牛乳中的酪蛋白多以膠束的形式存在，粒徑為20～300 nm，由αs1-，αs2-，β-，κ- 這4 種酪蛋白組成，其中κ-酪蛋白幾乎全部覆蓋在膠束的表面，通過(guò)其C末端的親水性與膠束表面的負(fù)電荷結(jié)合，從而使整個(gè)酪蛋白膠束穩(wěn)定地溶解在牛乳當(dāng)中[1]。

1.1 酶凝乳

酶凝乳是通過(guò)向牛乳中添加凝乳酶水解κ-酪蛋白的C末端，從而降低膠束之間的空間位阻，導(dǎo)致膠束發(fā)生聚集作用[2]。凝乳酶從牛的皺胃中提取，主要由胃蛋白酶與皺胃酶組成，能特異性地分解κ-酪蛋白的肽鍵Phe105-Met106，從而導(dǎo)致凝乳的形成[3]。酶凝乳的形成過(guò)程可分為3 個(gè)階段。第一階段，在凝乳酶的作用下，κ-酪蛋白分解為副κ-酪蛋白與酪蛋白巨肽（CMP），親水性CMP隨著乳清的排出而從膠束中釋放出來(lái)，使得酪蛋白表面負(fù)電荷減少，空間位阻降低[4]。當(dāng)κ-酪蛋白的酶解程度達(dá)到70%時(shí)，酪蛋白膠束的穩(wěn)定性下降，酶凝進(jìn)入第二階段[5]。在此階段，酪蛋白之間通過(guò)疏水鍵形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并通過(guò)Ca2+架橋作用形成凝膠。第三階段，乳清因脫水收縮作用而從酪蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中析出，凝乳形成。凝乳的形成主要由不同長(zhǎng)度尺寸下網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的重排造成，酪蛋白凝膠不同形式的重排如圖1所示。其重排形式主要有4 種，即分子與亞微粒子融合成顆粒（a）、顆粒間重排（b）、顆粒間形成鏈條（c）及肉眼可見(jiàn)的脫水收縮（d）[6]。在凝乳過(guò)程中，幾乎所有酪蛋白都參與重排過(guò)程，從而逐漸形成凝膠的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

1.2 酸凝乳

對(duì)于酸凝乳來(lái)說(shuō)，主要是通過(guò)pH值影響酪蛋白膠束的性質(zhì)[7]。隨著pH值的降低，酪蛋白中的膠體磷酸鈣（CCP）從中釋放，酪蛋白表面的負(fù)電荷被中和。當(dāng)pH值達(dá)到等電點(diǎn)4.6附近時(shí)，酪蛋白聚集沉淀，形成多孔而松散的聚集體。目前有關(guān)酸凝乳形成的機(jī)理尚未闡明，至少有3 種假設(shè)的模型[8]，即分形模型、浸透模型、膠球模型，且3 種模型均只能部分解釋凝乳的過(guò)程。如分形模型是利用分形理論解釋酸凝形成過(guò)程中，凝乳性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、組分的變化，此種模型能有效地將酪蛋白凝膠的部分性質(zhì)，如流變學(xué)性質(zhì)定量化，卻不能解釋聚集體的重排及滲透。

酸凝乳過(guò)程中隨著pH值的降低，凝乳的物化性質(zhì)發(fā)生顯著性變化。在pH值從6.7到6.0的過(guò)程中，酪蛋白表面負(fù)電荷降低，使得靜電排斥降低。由于只有少量的CCP會(huì)從酪蛋白膠束中溶解出來(lái)，酪蛋白膠束大小不變。在pH值從6.0到5.0的過(guò)程中，隨著進(jìn)一步酸化，酪蛋白之間的靜電斥力與空間位阻明顯下降，酪蛋白毛發(fā)層收縮。同時(shí)，pH值的下降使得酪蛋白的離子化作用減弱，從而降低其表面勢(shì)能，最終導(dǎo)致Ca2+與無(wú)機(jī)磷酸鹽的溶解釋放，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，CCP全部溶解釋放。在pH值從5.0到4.6的過(guò)程中，酪蛋白膠束隨著進(jìn)一步酸化而瓦解，pH值達(dá)到等電點(diǎn)時(shí)，酪蛋白表面的負(fù)電荷被中和，靜電斥力減弱，使得β-，κ-酪蛋白的兩親性減弱。又由于CCP的釋放，酪蛋白之間的靜電引力加強(qiáng)，使得αs-酪蛋白聚集最終通過(guò)簇團(tuán)連接成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠[9]。

2 酸-酶共促凝乳的過(guò)程及相關(guān)變化

2.1 酸-酶共促凝乳的過(guò)程

在酸-酶共促凝乳過(guò)程中，酸與凝乳酶為協(xié)同作用，酸化加強(qiáng)了酶解酪蛋白的聚集趨勢(shì)，凝乳酶的作用可減少酸化過(guò)程中去礦化對(duì)凝膠粘結(jié)力的負(fù)面影響，最終使凝膠結(jié)構(gòu)加強(qiáng)[10]。凝乳酶與酸共同促進(jìn)凝乳的過(guò)程可分為以下幾步[11]：（1）加入發(fā)酵劑，酸化至凝乳酶作用所需pH值。（2）加入凝乳酶，凝乳酶作用初始階段開(kāi)始，κ-酪蛋白發(fā)生水解。（3）凝乳酶作用第二階段，酪蛋白膠束聚集與凝膠形成，凝乳粘度增加。（4）酶凝乳型轉(zhuǎn)變?yōu)樗崮樾湍z，并伴隨微孔脫水作用；局部形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，使凝膠孔徑增大[12]，從而導(dǎo)致粘度減小。（5）酸凝作用占優(yōu)勢(shì)，酸凝膠形成，粘度第二次增加。（6）脫水收縮作用，酪蛋白收縮，導(dǎo)致微孔收縮（無(wú)乳清析出），接著大量的脫水收縮（可見(jiàn)乳清析出），粘度第二次減小。

由以上階段可知，酸-酶共促凝乳過(guò)程實(shí)際分為酶凝為主、酸凝為主的2 個(gè)過(guò)程，凝乳的物化性質(zhì)也呈現(xiàn)出明顯的層次。

2.2 酸-酶共促凝乳過(guò)程中物化性質(zhì)的變化

在酸促凝乳過(guò)程中，酸的作用使體系發(fā)生了2 個(gè)方面的變化，即酪蛋白表面負(fù)電荷的減少與膠體磷酸鈣的逐漸溶解。這一變化影響了酪蛋白的亞穩(wěn)定性，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)重排，最終形成穩(wěn)定狀態(tài)的凝膠[13]。酸-酶共促凝乳過(guò)程中的物化變化與以上所述酸凝過(guò)程相似，但也存在著一些不同。少量凝乳酶的添加并不影響膠體磷酸鈣從酪蛋白中的分離，但會(huì)導(dǎo)致β-酪蛋白分離最大值出現(xiàn)延遲[14]。在酸-酶共促凝乳中，pH值從6.7降到4.6，酪蛋白的容積度與溶解性緩慢降低。在酸凝乳中，容積度與溶解性的最大值在pH值5.3時(shí)出現(xiàn)，酶凝乳則為pH值5.6。

在粘度方面，酸酶共促凝乳的粘度隨時(shí)間的變化而變化，當(dāng)粘度值達(dá)到局部最大值后凝乳的硬度將下降。這是由酶凝膠形成時(shí)的去礦化作用造成的，這一過(guò)程完成在pH值5.3到5.1范圍內(nèi)[15]。流變學(xué)性質(zhì)方面，以pH值5.2為分界點(diǎn)，若凝膠形成時(shí)pH值>5.2，則其流變學(xué)性質(zhì)更趨向于酶凝膠。若凝膠形成時(shí)pH值<5.2，則其流變學(xué)性質(zhì)更趨向于酸凝膠。當(dāng)pH值為5.2時(shí)，酶凝膠有非常高的滲透系數(shù)與損失正切值，說(shuō)明蛋白質(zhì)之間的相互連接逐漸弛緩[16]。

酸酶共促凝乳過(guò)程中，凝乳由酶凝型逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗?酶凝型。在此期間，由于微孔脫水作用，使得凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)粗化，達(dá)到粘度與凝膠模量的局部最小值[17]。在微孔脫水作用過(guò)程中，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)部分位置逐漸緊密，部分位置逐漸松散。隨著pH值的降低，孔徑及滲透系數(shù)增加。

當(dāng)在酸化初期加入少量的凝乳酶時(shí)，低pH值加快了酶解反應(yīng)的速度，形成粗糙的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而形成更高強(qiáng)度的凝膠。由于酪蛋白部分熔合，攪拌時(shí)酸酶凝膠較酸凝膠更加粘稠[18]。在不同的農(nóng)家干酪的生產(chǎn)過(guò)程中，酸凝凝塊中酪蛋白顆粒較酸-酶凝顆粒小。與pH值=4.6的酸凝膠（損耗正切值tanб=0.27）或酸-酶共促凝膠（tanб=0.26）相比，pH值=6.7的酶凝膠[19]（tanб=0.60）更加粘稠。由于tanб與蛋白質(zhì)之間的連接張弛程度有關(guān)，且酶凝凝膠更易脫水，因此隨著凝乳酶溶度的增加，酸-酶共促凝膠的脫水作用顯著增強(qiáng)[20]。

2.3 影響酸-酶共促凝乳的主要因素

2.3.1 凝乳酶的濃度

目前，在夸克干酪與特沃勞格干酪的生產(chǎn)過(guò)程中，都會(huì)加入少量的凝乳酶以改善凝塊排水的能力，減少酪蛋白細(xì)屑的產(chǎn)生，增加凝塊的強(qiáng)度[21]。夸克干酪生產(chǎn)中凝乳酶的用量為2～20 mL標(biāo)準(zhǔn)活力的凝乳酶/1000 L牛乳。凝乳酶的添加使酪蛋白在酸化過(guò)程中更易聚集，酸化初期酪蛋白凝集部分與未凝集部分的比值增加。如果夸克干酪僅用酸化生產(chǎn)，則凝乳切割點(diǎn)在pH值4.5～4.7范圍內(nèi)，而加入少量凝乳酶后由于酶解生成的副κ-酪蛋白的等電點(diǎn)高于κ-酪蛋白，凝乳切割pH值變?yōu)?.8～4.9[22]。因此，可以通過(guò)添加酶防止過(guò)度酸化。然而凝乳酶能分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生多肽類的苦味物質(zhì)，從而導(dǎo)致夸克干酪的苦味產(chǎn)生。因此需加入合適濃度的凝乳酶，在提高凝乳酶作用的同時(shí)降低苦味的形成。

研究表明，凝乳酶的添加縮短了凝乳時(shí)間，凝膠形成時(shí)pH值增大，凝乳酶濃度與凝乳時(shí)間及粘度局部極大值所用時(shí)間成負(fù)相關(guān)。在濃度0～20 mL/1000 L內(nèi)，隨著凝乳酶濃度的增加，凝乳開(kāi)始時(shí)及粘度局部極大時(shí)的pH值分別從5.44增至6.31，5.05增至5.38。然而，在pH值6.45、30 ℃下加入凝乳酶，添加不同凝乳酶濃度后的凝乳粘度的局部最小值與最后的粘度最大值出現(xiàn)在相同的pH值，即分別為4.95與4.45，且粘度的局部最大值恒定不變。凝乳酶濃度達(dá)到1.7～2.2 mL凝乳酶/1000 L牛奶時(shí)，凝膠形成速度最快，此濃度被視為關(guān)鍵濃度[23]。當(dāng)凝乳酶的濃度高于關(guān)鍵濃度值時(shí)，酸、酶凝膠過(guò)程中稠度將出現(xiàn)局部極大與局部極小值。在以大于關(guān)鍵濃度的量添加凝乳酶后，粘度曲線中的局部最大值的拐點(diǎn)、局部最小值、最大值都將有所降低。不僅酸-酶共促產(chǎn)生的凝膠硬度大，而且酸-酶共促凝膠的攪拌型產(chǎn)品，如夸克干酪的表觀粘度比單獨(dú)酸化時(shí)高，酸-酶共促夸克干酪的脫水收縮作用也強(qiáng)于單獨(dú)酸化型夸克干酪[24]。

2.3.2 熱處理

在干酪加工中，熱處理是必不可少的生產(chǎn)環(huán)節(jié)之一。當(dāng)熱處理溫度高于70 ℃時(shí)，乳中部分乳清蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白變性，通過(guò)疏水作用、分子間二硫鍵作用與κ-酪蛋白之間形成復(fù)合物。變性的乳清蛋白增加了締合反應(yīng)的敏感性，使得乳清蛋白與κ-酪蛋白之間形成二硫鍵[25]。當(dāng)加熱溫度為80 ℃時(shí)，乳清有30%發(fā)生變性，酸-酶共促凝膠的水合作用與表觀粘度值顯著增高。對(duì)于新鮮干酪，乳清蛋白變性的最佳程度為75%～80%。如果變性程度過(guò)低，干酪表現(xiàn)為柔軟、不順滑。相反，如果變性程度過(guò)高，如加熱到120 ℃時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致新鮮干酪的沙質(zhì)感。因此，目前生產(chǎn)中多采用溫度88～95 ℃，時(shí)間3～6 min的熱處理。

目前，有關(guān)未經(jīng)熱處理酸酶共促凝乳的自動(dòng)脫水收縮作用有較多的報(bào)道。共聚焦電子掃描顯微鏡結(jié)果顯示，未經(jīng)熱處理的酸酶共促凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑大于經(jīng)熱處理的酸酶共促凝膠，且熱處理后的凝膠網(wǎng)絡(luò)連接較多。這一結(jié)果與滲透系數(shù)的變化一致。由于酸酶共促凝膠形成初期會(huì)發(fā)生聚集體的大量重排，使得未經(jīng)熱處理的酸酶共促凝膠更易自發(fā)地排出乳清[26]。

在純酸凝過(guò)程中，隨著熱處理程度的加深，凝膠形成的速度不斷加快，凝膠形成時(shí)的pH值增大。然而在酸酶共促凝乳熱處理后，凝膠pH值點(diǎn)恒定在6.3，但粘度增長(zhǎng)的局部極大值的pH值點(diǎn)從5.6降至5.0。熱處理下，酸-酶共促凝膠粘度的初期增長(zhǎng)將有所下降，這與酶凝作用的第二階段相關(guān)。研究表明，在低凝乳酶添加下，熱處理對(duì)酶凝作用的第一階段酶解反應(yīng)的進(jìn)行影響較小[27]。熱處理后，由于酪蛋白之間被乳清蛋白連接，使得酸-酶共促凝膠較未熱處理凝膠硬度大。同時(shí)，由于脫水作用減弱，導(dǎo)致局部極大或極小值不顯著。熱處理后，tanб值由0.51降至0.43，說(shuō)明酪蛋白的大量重排減弱[28]。

2.3.3 添加凝乳酶時(shí)的pH值

目前，在夸克干酪的生產(chǎn)當(dāng)中，凝乳酶一般在發(fā)酵劑加入后60～90 min添加，此時(shí)的pH值為6.3。凝乳酶的添加時(shí)間點(diǎn)及其對(duì)干酪結(jié)構(gòu)品質(zhì)的影響主要靠經(jīng)驗(yàn)判斷，添加凝乳酶的pH值點(diǎn)從原乳pH值到6.00不等，主要集中在6.30～6.45。對(duì)于酶凝乳，降低pH值能顯著地縮短凝乳時(shí)間，其最佳pH值為6.0[29]。隨著pH值的降低，酪蛋白聚集開(kāi)始所需的κ-酪蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦?κ-酪蛋白的酶解程度逐漸降低，pH值6.7時(shí)為70%，pH值 5.6時(shí)為30%。同時(shí)，會(huì)導(dǎo)致酪蛋白聚集與凝膠形成的速度增加。這主要是因?yàn)榈蚿H值下Ca2+的活力強(qiáng)，當(dāng)pH值從6.8降至6.3時(shí)，酪蛋白的聚集速度增倍[32]。較低的pH值可能導(dǎo)致更快的聚集體的重排與膠團(tuán)的融合，從而使彈性模量在凝膠點(diǎn)到平穩(wěn)值期間的增長(zhǎng)速度增加。隨著pH值的降低，酸-酶共促凝乳所用的時(shí)間將明顯降低[30]。在如下幾個(gè)階段中，凝乳有顯著性的差異：（1）在pH值5.98～6.62范圍內(nèi)，加入低濃度凝乳酶時(shí)，凝乳時(shí)間隨pH值的下降而顯著縮短，而加入高濃度凝乳酶時(shí)，凝乳時(shí)間則與添加凝乳酶時(shí)的pH值無(wú)關(guān)。隨著pH值的降低，酸酶共促凝膠的粘度局部極大值增加。（2）在pH值 5.8～6.6內(nèi)添加凝乳酶，凝膠最終的粘度無(wú)顯著性差異。然而最初的聚集反應(yīng)受添加酶時(shí)pH值影響大。（3）在pH值低于6.0時(shí)，凝乳酶添加后粘度的局部極大或極小變得不顯著。

另外，酸-酶共促的凝固點(diǎn)（pH值 5.63～6.40）、粘度值的第1 個(gè)拐點(diǎn)（pH值 5.17～5.65）及粘度局部極大值（pH 值5.02～5.16）與凝乳酶添加時(shí)的pH值（5.8～6.6）直接相關(guān)，而局部極小值、第3 個(gè)拐點(diǎn)（pH值4.8～4.85）及最后的極大值僅與酸化有關(guān)，與添加凝乳酶時(shí)的pH值無(wú)關(guān)。當(dāng)pH值>5.9時(shí)，添加凝乳酶時(shí)的pH值并不影響粘度的局部極大值、極小值及最終極值的數(shù)量級(jí)大小。目前，有關(guān)添加凝乳酶時(shí)pH值如何影響最終酸酶共促凝乳所生產(chǎn)的干酪產(chǎn)品的流變學(xué)特性或脫水收縮的文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。

除以上因素外，影響酸-酶共促凝乳的因素還包括凝乳時(shí)的溫度、超濾處理、發(fā)酵劑與Ca2+濃度等[31～33]，然而這些因素的作用較為復(fù)雜。有關(guān)Ca2+濃度對(duì)酸-酶共促凝乳影響的研究表明，只有當(dāng)凝乳酶的添加量達(dá)到10 mL/1000 L時(shí)，才對(duì)酸-酶共促凝乳的形成產(chǎn)生影響。由于酸-酶共促凝乳影響的因素之間存在著一定的聯(lián)系，因此還需進(jìn)一步探討多因素對(duì)酸-酶共促凝乳形成的影響。

3 小結(jié)與展望

由于酸-酶共促凝乳中涉及的反應(yīng)與結(jié)構(gòu)變化較為復(fù)雜，凝乳機(jī)制的研究較為困難。因此盡管酸-酶共促凝乳方式對(duì)于新鮮干酪的生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義，有關(guān)酸-酶共促凝乳的研究仍然較少，為進(jìn)一步明確酸、凝乳酶在酸-酶共促凝乳中的作用，還需進(jìn)行以下工作：（1）明確酸、凝乳酶在促進(jìn)凝乳形成過(guò)程中所貢獻(xiàn)作用的強(qiáng)弱大小的變化。（2）在增大凝乳酶量的情況下，研究酶量、酸量及特定質(zhì)地凝塊之間的關(guān)系，以期為獲得特異性產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。（3）進(jìn)一步加強(qiáng)熱處理、凝乳酶濃度、添加凝乳酶時(shí)pH等因素組合對(duì)酸-酶共促凝乳影響的研究。

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