郭育奇，趙春燕

·綜述·

電子基因微芯片在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

郭育奇，趙春燕

基因芯片（DNA microchip）也稱 DNA 微陣列（DNA microarray），是把大量基因探針或基因片段按特定的排列方式固定在芯片載體上，形成致密有序的 DNA 分子點(diǎn)陣，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與樣品 DNA 雜交，然后通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行解讀和分析獲取大量信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品高效、平行地檢測(cè)或醫(yī)學(xué)診斷。由于具有高通量、快捷、便宜等優(yōu)點(diǎn)，基因芯片在各個(gè)領(lǐng)域起著越來越重要的作用。芯片可以根據(jù)探針的性質(zhì)、固體表面的支撐物、探針尋址或目標(biāo)檢測(cè)方法的不同分為原位合成寡核苷酸微陣列（situ-synthesized oligonucleotide microarray）、高密度微珠陣列（high-density bead arrays）、電子微芯片（electronic microarrays）等。近年來，電子微芯片技術(shù)的發(fā)展越來越引起人們的關(guān)注，它是利用電場、熱循環(huán)或化學(xué)方法等吸引帶負(fù)電的 DNA 或其他生物分子和探針結(jié)合到芯片特定位點(diǎn)上從而進(jìn)行主動(dòng)雜交檢測(cè)[1]。該種芯片在精確性、準(zhǔn)確性和嚴(yán)格性控制方面優(yōu)于傳統(tǒng)芯片，可用于病原生物的檢測(cè)和鑒定、微生物的分型、基因表達(dá)分析、基因突變及多態(tài)性分析、疾病診斷和預(yù)測(cè)等。本文就電子基因芯片的工作原理、優(yōu)勢(shì)和在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用作簡要綜述。

1　電子基因芯片的工作原理和操作流程

電子基因芯片的工作原理如圖 1 所示，它可借助電子場加快帶電的生物分子結(jié)合到芯片上的速度。芯片上的每一個(gè)位點(diǎn)代表了一個(gè)電極，每一個(gè)電極都可被分別通電。通電后產(chǎn)生的電場可加速帶負(fù)電的 DNA 探針或其他生物分子的結(jié)合。電子場一方面吸引特異性的寡核苷酸探針到特定位點(diǎn)，另一方面捕獲目的 DNA 并特異性雜交到寡聚探針上。芯片載體上建有電極矩陣，其上的每一個(gè)位點(diǎn)都有一個(gè)獨(dú)立的金屬線接頭。該矩陣通過標(biāo)準(zhǔn)的硅平版印刷術(shù)被組合在一起，并用 CMOS 片包埋，CMOS 片上的每個(gè)電極可被電壓和電流單獨(dú)控制。整個(gè)矩陣被包埋入一個(gè)一次性流體式的芯片中，這樣便可提供一個(gè)樣品或試劑的自動(dòng)控制。電極矩陣上覆蓋了一層 1 ～ 2 μm 厚的水凝膠滲透層，該層含有親合素，親合素促使探針或目的基因被直接捕獲。在矩陣操作過程中，高電位促使水在陽極發(fā)生氧化反應(yīng)，陰極發(fā)生還原反應(yīng)。水的氧化反應(yīng)產(chǎn)物是 H+和氧。這項(xiàng)技術(shù)就是利用陽極產(chǎn)生的 H+進(jìn)行高效率的 DNA 雜交。反過來，如果陰極被激活產(chǎn)生 OH–，這樣帶負(fù)電的 DNA 分子就遠(yuǎn)離電極。因此，這種電子式的嚴(yán)格性可識(shí)別出單個(gè)堿基的不同，因而可用來分析單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）[2-3]。

Nanogen 公司生產(chǎn)的 Nanochip 檢測(cè)系統(tǒng)包括 3 個(gè)部分：微電子芯片、上樣系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。微電子芯片是由 100 或 400 個(gè)位點(diǎn)組成，通過連接器來控制。通過對(duì)位點(diǎn)微電極的電位控制，在微電極的上方完成探針分子的選擇性固定，靶核酸定向轉(zhuǎn)移集中并與探針主動(dòng)雜交。上樣系統(tǒng)是通過電場作用將探針或其他分子錨定到微電子芯片上，錨定完成之后對(duì)非特異性結(jié)合的物質(zhì)進(jìn)行洗滌，減少干擾反應(yīng)。檢測(cè)系統(tǒng)用來檢測(cè)雜交后熒光信號(hào)的強(qiáng)度。運(yùn)用互補(bǔ)金屬氧化半導(dǎo)體技術(shù)來進(jìn)行核酸的電子尋址，如果探針和目的 DNA之間發(fā)生了特異性雜交反應(yīng)，電子芯片被掃描后將呈現(xiàn)陽性結(jié)果[3-4]。

圖1　電子基因芯片的工作原理圖

2　電子基因芯片的優(yōu)勢(shì)

與傳統(tǒng)的基因芯片相比，Nanochip 電子基因芯片具有如下幾點(diǎn)獨(dú)特性：①Nanochip 系統(tǒng)利用電子場和熱循環(huán)技術(shù)，達(dá)到了精確性、準(zhǔn)確性和嚴(yán)格性的控制。②在芯片上，通過對(duì)電位的控制來移動(dòng)和濃縮 DNA，對(duì)生物分子的電子吸引力大大加速了分子結(jié)合到芯片上的速度，與傳統(tǒng)的被動(dòng)式芯片（如 Affymetrix，Genechip）相比，增加了 1000 倍以上。被動(dòng)式芯片的點(diǎn)樣需要花幾個(gè)小時(shí)，而主動(dòng)式電子芯片僅需要 30 ～ 60 s。因而，這種高效性可使 Nanochip 檢測(cè)極低濃度的靶基因。③多重性分析：電子式芯片提供了一個(gè)靈活的平臺(tái)。例如，在同一個(gè)芯片上可同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣品的多個(gè)基因，或一個(gè)基因的多個(gè)樣品，或多個(gè)樣品的多個(gè)基因。相反，傳統(tǒng) DNA 芯片上的位點(diǎn)不能被分別控制，因此，只能檢測(cè)一個(gè)樣品的多個(gè)基因。該系統(tǒng)還配有晶載內(nèi)存，用于儲(chǔ)存遺傳分析和檢測(cè)傳染病病原體的關(guān)鍵信息，為多路的檢測(cè)運(yùn)轉(zhuǎn)提供了更高的通量。以最小的消耗來檢測(cè)多樣的目標(biāo)產(chǎn)物。④電子式嚴(yán)格性：可識(shí)別單一堿基的不同，并可確定單核苷酸多態(tài)性。⑤結(jié)構(gòu)開放性：允許實(shí)驗(yàn)用戶定義、選擇和建立個(gè)性化的測(cè)試面板或從預(yù)先設(shè)定好的分析物特效試劑（analyte specific reagents，ASRs）中選擇。⑥性價(jià)比高：該系統(tǒng)簡化了工作流程，縮短了手動(dòng)操作的時(shí)間。將開發(fā)和檢測(cè)突變的功能集中在一張芯片上，比傳統(tǒng)的芯片性價(jià)比高[2, 5-6]。

3　電子基因芯片在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

3.1微生物的檢測(cè)和鑒定

在臨床微生物學(xué)研究中，通過中低密度的電子基因微芯片對(duì)微生物的目標(biāo)遺傳序列進(jìn)行評(píng)價(jià)是非常重要的。檢測(cè)中最常用的靶基因是細(xì)菌中的 16S rRNA、真菌中的 28S rRNA 和 rRNA 基因間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)[7]。在芯片檢測(cè)前需對(duì)樣本用寬范圍 PCR 或多重 PCR 處理，該措施可有效地提高靈敏度。在基因多樣性的篩選中，微芯片的平行性也高于其他篩選方法。對(duì)于細(xì)菌中的分枝桿菌屬可將 gyrB、rpoB 和 katG 基因作為目標(biāo)基因。Sanguinetti 等[8]用 Nanochip電子微陣列來鑒定臨床相關(guān)分枝桿菌的種屬。先將臨床菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后用 PCR 方法擴(kuò)增分枝桿菌的 rRNA基因，最后將產(chǎn)物和種屬選擇性的探針進(jìn)行雜交。結(jié)果證明該方法比傳統(tǒng)的鑒定方法更加快速、精確。

電子基因芯片結(jié)合寬范圍的 PCR 技術(shù)還可用于檢測(cè)和鑒定真菌、寄生蟲和病毒病原體。Takahashi 等[9]對(duì)流感病毒 A 和 B，呼吸道合胞病毒，副流感病毒 1，2，3 型進(jìn)行檢測(cè)。比較了 Nanochip 400 系統(tǒng)和直接熒光抗體染色法（direct fluorescent-antibody staining，DFA）兩種方法檢測(cè) 122 份標(biāo)本的結(jié)果，兩者一致性達(dá)到 86.9％。若把 DFA作為檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，Nanochip 400 系統(tǒng)的靈敏度和特異度分別為 84.6％ 和 100％。差異分析表明 Nanochip 400 系統(tǒng)靈敏度和特異度可達(dá) 98.6％ 和 100％。同時(shí)還比較了Nanochip 400 系統(tǒng)和實(shí)時(shí)定量 PCR（real-time PCR）兩種方法檢測(cè) 130 份標(biāo)本的結(jié)果，兩者的一致性為 93.9％。在差異分析中，Nanochip 400 系統(tǒng)敏感性和特異性分別為98.6％ 和 100％，而且 Nanochip 400 系統(tǒng)檢測(cè)過程在 4 h內(nèi)即可完成。由此可見 Nanochip 系統(tǒng)檢測(cè)法是一種簡便、快速、靈敏的檢測(cè)常見呼吸道病毒的方法。

除此之外，該芯片還可以用于檢測(cè)環(huán)境中的有害微生物，防止因有害微生物大量繁殖造成的疾病或生態(tài)災(zāi)難。Barlaan 等[10]對(duì)有害藻類大量繁殖過程（harmful algal blooms，HABs）中的細(xì)菌聚集物進(jìn)行研究。通過變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）對(duì) 16S rRNA 基因進(jìn)行分析。而后設(shè)計(jì)并合成特異的Nanochip微陣列的探針，通過雜交反應(yīng)檢測(cè)物種。該方法可檢測(cè) HABs 的發(fā)生和相對(duì)豐度，并可找出與 HABs 發(fā)生相關(guān)的核酸序列，該研究表明電子微陣列可檢測(cè)和監(jiān)控環(huán)境中的微生物。

3.2微生物的分型

利用電子基因芯片對(duì)不同種類基因組做檢測(cè)可對(duì)微生物進(jìn)行分型。該技術(shù)能克服傳統(tǒng)分型方法的許多限制，與遺傳學(xué)方法相結(jié)合后可補(bǔ)充或取代傳統(tǒng)的血清型方法。該技術(shù)現(xiàn)已用于病原體及其繁殖，患者的再感染與復(fù)發(fā)，患者的院內(nèi)感染以及抗藥性菌株傳播等方面的研究。

Saunders 等[11]通過膜蛋白基因 V1 區(qū)對(duì)人類免疫缺陷病毒 1 型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）進(jìn)行分型。通過對(duì)樣品進(jìn)行巢式反轉(zhuǎn)錄 PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物與 Nanochip 微陣列相連后與寡核苷酸探針雜交，根據(jù)探針雜交的模式對(duì)病毒株分型。文中將該方法與測(cè)序方法或異源雙鏈遷移率分析法（heteroduplex mobility assay，HMA）比較，不但準(zhǔn)確性可與后兩種方法相媲美，并且是一種方便和高效的 HIV-1 分型方法。

在雷特綜合征患者中，女性 X 染色體相偶聯(lián)的MeCP2 基因中的 8 個(gè)點(diǎn)突變占了正向突變總數(shù)的 70％。Thistlethwaite 等[12]以 Nanogen 系統(tǒng)為基礎(chǔ)開發(fā)出了一種新的方法來檢測(cè)這 8 個(gè)突變。然后將結(jié)果與變性高效液相色譜和測(cè)序方法結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明該分型技術(shù)表現(xiàn)出100％ 的特異性和 3％ 的多義性。在特異性和精確性方面，該方法與單引物擴(kuò)增反應(yīng)在同一水平，并且更快更經(jīng)濟(jì)。

3.3基因的差異表達(dá)分析

微芯片技術(shù)顯著地增強(qiáng)了對(duì)基因差異表達(dá)的檢測(cè)能力。與傳統(tǒng)的微芯片相比，電子基因芯片能更快、更精確地分析不同組織中基因表達(dá)的變化。通過檢測(cè)基因的差異表達(dá)，從而研究特殊基因與疾病之間關(guān)系。對(duì)疾病的診斷和治療有重要意義。Corradi 等[13]應(yīng)用該芯片對(duì)人白血病相關(guān)的融合基因進(jìn)行研究。特定基因的表達(dá)量、基因多態(tài)性分布等生物學(xué)特征，在危險(xiǎn)分層、靶向治療或檢測(cè)微量殘存疾病的標(biāo)記等方面有重要作用。作者將多重 RT-PCR、電雜交技術(shù)與Nanochip 系統(tǒng)相結(jié)合，對(duì)人普通的白血病轉(zhuǎn)錄融合基因進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)證明該方法是高效的基因表達(dá)分析方法。

3.4基因突變檢測(cè)和多態(tài)性分析

研究表明大多數(shù)疾病是由多個(gè)核苷酸突變引起的，因此研究這些核苷酸突變能獲取有價(jià)值的醫(yī)學(xué)信息。在臨床診斷中，單核苷酸多態(tài)性可作為識(shí)別疾病基因的遺傳標(biāo)志，它既可用于分析病人與對(duì)照組之間的相關(guān)性又可解釋同種微生物之間的接合作用。通過 SNP 分析可繪制和診斷疾病相關(guān)的等位基因。電子微陣列技術(shù)簡單、快速、自動(dòng)化程度高，可用來篩選和檢測(cè)大量相關(guān)的 SNP，從而確定特殊微生物的 SNP 和應(yīng)答病原體毒素的 SNP。

Evans 等[14]建立了一種以 Nanochip 系統(tǒng)為基礎(chǔ)的新方法來檢測(cè)凝血因子 V Leiden（factor V Leiden，F(xiàn)VL）中點(diǎn)突變，而后將該方法得出的結(jié)果與 Third Wave 分析法得出結(jié)果進(jìn)行比較。Nanochip 系統(tǒng)在野生型，雜合子和純合子特征化的精確度均為 100％，而 Third Wave 分析的精確度為 99.2％，90.2％ 和 100％，前者顯然優(yōu)于后者。同樣可對(duì)家族性地中海熱（familial Mediterranean fever，F(xiàn)MF）中FMF（MEFV），factor V（F5）和 factor II（F2）基因型進(jìn)行鑒定，并做突變和 SNP 分析。結(jié)果證明新方法是一種自動(dòng)化、高通量的 SNP 檢測(cè)方法[15]。

在兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）人中，硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）活性、基因型對(duì) 6-硫嘌呤（6-mercaptopurine，6-MP）化療個(gè)體化有重要意義。Albayrak 等[16]以患 ALL 病的土耳其兒童為研究對(duì)象，應(yīng)用 Nanochip 技術(shù)對(duì)患者的遺傳多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，探究多態(tài)性與個(gè)體低 TPMT 活性和耐受 6-MP 突變體之間的關(guān)系。檢測(cè)結(jié)果表明患者 TPMT 多態(tài)性頻率和分布與其他白種人相似，而 6-MP 毒性過大導(dǎo)致突變體的產(chǎn)生，所以對(duì)TPMT 基因的分型須在用 6-MP 治療之前完成。

在慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）和彌散性支氣管擴(kuò)張（disseminated bronchiectasis，DB）患者中，Papatheodorou等[17]對(duì) TNF-α基因啟動(dòng)子的多態(tài)性與基因的轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)系進(jìn)行研究，運(yùn)用 Nanochip 系統(tǒng)對(duì) 5 個(gè)啟動(dòng)子的 SNP 進(jìn)行分析。結(jié)果顯示在 COPD 組、DB 組和健康吸煙者組三者之間 5 個(gè)SNP 的基因型頻率沒有顯著性差異。僅 COPD 患者組的單倍體頻率（haplotype frequencies）與普通人組之間出現(xiàn)了差異。在確定遺傳風(fēng)險(xiǎn)度研究中，作者對(duì) SERPINA1、2 和ADRB2 基因中的 5 個(gè) SNP 進(jìn)行分型。結(jié)果表明SERPINA1 中 p.V213A 的多態(tài)性與 DB 的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。ADRB2 的 p.G16R 是嚴(yán)重 COPD 風(fēng)險(xiǎn)因素[18]。

3.5其他方面

除此之外，Weigum 等[19]開發(fā)出了一種新型的 BNC 傳感技術(shù)（bio-nanochip sensor technique），并用此技術(shù)檢測(cè)脫屑性細(xì)胞學(xué)（exfoliative cytology）樣品中的口腔癌細(xì)胞和生物標(biāo)記物（oral cancer biomarkers）。通過對(duì) 41 例牙科患者和 11 例正常人的樣品的表皮細(xì)胞和表皮生長因子受體（EGFR）進(jìn)行檢測(cè)和分析，包括細(xì)胞核直徑和面積、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)（N/C）比例、生物標(biāo)記的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎所有細(xì)胞的這 4 項(xiàng)關(guān)鍵的參數(shù)都得到明顯的提高。將檢測(cè)的一系列特征結(jié)果進(jìn)行綜合分析，能特異性地提高對(duì)口腔癌及癌變前的狀態(tài)的辨別力度。

在卵巢癌的早期診斷方面，Raamanathan 等[20]應(yīng)用程序化的生物納米芯片（programmable bio-nano-chip）平臺(tái)對(duì)樣品中的生物標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。該技術(shù)可在 45 min內(nèi)對(duì)血清中 CA125 做定量檢測(cè)和分析。該系統(tǒng)在卵巢癌診斷過程中有非常好的應(yīng)用前景。

4　電子基因微芯片前景展望

電子基因芯片發(fā)展到現(xiàn)在不足十年的時(shí)間，通過它，人類顯著地提高了認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)的能力，為研究生命這個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)打下基礎(chǔ)[21]?，F(xiàn)在各國的研究機(jī)構(gòu)都在對(duì)此進(jìn)行積極的研究，電子基因芯片在基因表達(dá)譜分析、病原生物鑒定、基因分型、突變檢測(cè)及單核苷酸多態(tài)性分析等方面都已呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。雖然電子基因芯片技術(shù)還存在問題，但隨著新技術(shù)和新思想的不斷產(chǎn)生，電子基因芯片的發(fā)展與完善將對(duì)醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[22]。

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DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.010

基金項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)生廳項(xiàng)目（2008Z001）

作者單位：130021 長春，吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系

通訊作者：趙春燕，Email：chunyanzhao44@yahoo.com

收稿日期：2012-03-16