陳保文，都偉欣，杜蓉，閆李俠，郭磊，楊蕾，王國治

·論著·

反相高效液相色譜法和16S rRNA序列分析法對分枝桿菌分型鑒別的比較研究

陳保文，都偉欣，杜蓉，閆李俠，郭磊，楊蕾，王國治

目的比較反相高效液相色譜法（RP-HPLC）和 16S rRNA序列分析法對分枝桿菌分型鑒別的異同。

分枝桿菌屬； 分枝菌酸； 色譜法，高壓液相； 細(xì)菌分型技術(shù)； 序列分析，DNA； 16S rRNA

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(4):263-269

我國是全球 22 個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，肺結(jié)核患者數(shù)位居世界第二。2000 年全國第四次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告顯示非結(jié)核分枝桿菌（NTM）感染比例明顯增加，1984 – 1985 年為 4.2％，1990 年為 4.9％，而 2000 年則增至11.1％[1]。NTM 所引起的結(jié)核樣病變與結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病臨床表現(xiàn)相似，很難鑒別，但藥物敏感性和化療方案根據(jù)不同菌種有所不同。因此，分枝桿菌菌種的快速鑒定不僅在流行病學(xué)上，而且在臨床診斷和治療上均有十分重要的意義。

結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌統(tǒng)稱為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTB），和 NTM 在微生物分類中均屬于放線菌目分枝桿菌科分枝桿菌屬。涂片鏡檢均呈抗酸桿菌陽性，培養(yǎng)特性和生化反應(yīng)雖然被稱為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但所需時間長且步驟繁瑣。分枝桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)中含有豐富的分枝菌酸（mycolic acid，MA），MA 是一類高分子量的含有 α-支鏈、β-羥基脂肪酸的化合物，其脂肪酸上碳鏈的長度、不飽和狀態(tài)、官能團(tuán)及含量在各生物種型之間呈現(xiàn)指紋特征的特點(diǎn)。因此，利用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）對分枝桿菌的分枝菌酸進(jìn)行色譜圖的構(gòu)建，可將分枝桿菌鑒定到種的水平。rRNA 基因被稱為細(xì)菌的“活化石”，是目前細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類與鑒定的最常用靶基因，其中 16S rRNA 基因因其大小適中、信息量大且高度保守，又能利用測序技術(shù)較易得到其序列，故被細(xì)菌學(xué)家和分類學(xué)家所接受[2]。本研究針對《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中載入的 54 種分枝桿菌中的 49 種模式株采用 RP-HPLC 和 16S rRNA 基因序列分析法分別進(jìn)行了 MA 色譜圖的構(gòu)建和 16S rRNA基因測序，以比較兩種方法對分枝桿菌分型鑒別結(jié)果的異同。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 鳥分枝桿菌（M. avium，95001）、胞內(nèi)分枝桿菌（M. intracellulare，95002）、蟾蜍分枝桿菌（M. xenopi，95003）、潰瘍分枝桿菌（M. ulcerans，95004）、土地分枝桿菌（M. terrae，95005）、胃分枝桿菌（M. gastri，95006）、不產(chǎn)色分支桿菌（M. nonchromogenicum，95007）、施氏分枝桿菌（M. shimoidei，95008）、次要分枝桿菌（M. triviale，95009）、產(chǎn)鼻疽分枝桿菌（M. farcinogenes，95012）、堪薩斯分枝桿菌（M. kansasii，95013）、海分枝桿菌（M. marinum，95014）、猿猴分枝桿菌（M. simiae，95015）、亞洲分枝桿菌（M. asiaticum，95016）、瘰疬分枝桿菌（M. scrofulaceum，95017）、戈登分枝桿菌（M. gordonae，95018）、蘇加分枝桿菌（M. szulgai，95019）、龜分枝桿菌龜亞種（M. chelonae subsp. Chelonae，95020）、龜分枝桿菌膿腫亞種（M. chelonae subsp. Abscessus，95021）、偶然分枝桿菌（M. fortuitum，95022）、恥垢分枝桿菌（M. smegmatis，95023）、草分枝桿菌（M. phlei，95024）、抗熱分枝桿菌（M. thermoresistibile，95025）、愛知分枝桿菌（M. aichiense，95026）、金色分枝桿菌（M. aurum，95027）、楚布分枝桿菌（M. chubuense，95028）、杜氏分枝桿菌（M. duvalii，95029）、微黃分枝桿菌（M. flavescens，95030）、加地斯分枝桿菌（M. gadium，95031）、淺黃分枝桿菌（M. gilvum，95032）、科莫斯分枝桿菌（M. komossense，95033）、新金色分枝桿菌（M. neoaurum，95034）、奧布分枝桿菌（M. obuense，95035）、副偶然分枝桿菌（M. parafortuitum，95036）、羅德島分枝桿菌（M. rhodesiae，95037）、東海分枝桿菌（M. tokaiense，95038）、豬分枝桿菌（M. porcinum，95039）、灰塵分枝桿菌（M. pulveris，95040）、塞內(nèi)加爾分枝桿菌（M. senegalense，95041）、詭詐分枝桿菌（M. fallax，95042）、田野分枝桿菌（M. agri，95043）、南非分枝桿菌（M. austroafricanum，95044）、迪氏分枝桿菌（M. diernhoferi， 95045）、千田分枝桿菌（M. chitae，95046）、田鼠分枝桿菌（M. microti，95048）、非洲分枝桿菌（M. africanum，95049）、母牛分枝桿菌（M. vaccae，95051）、結(jié)核分枝桿菌（M. tuberculosis，95053）、牛分枝桿菌（M. bovis，95055）共 49 株，均由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心[CMCC（B）]提供。

1.1.2主要試劑 色譜純甲醇、二氯甲烷和氯仿均為美國 J. T. Baker 公司產(chǎn)品；色譜純雙環(huán)己基-18-冠-6 醚及 4-溴苯乙酰基溴為美國 Fluka 公司產(chǎn)品；高分子量內(nèi)標(biāo)（HW-ISTD）由美國疾病預(yù)防控制中心的 Butler W.R. 贈送。PCR 擴(kuò)增引物和測序引物相同，均由上海英駿生物工程有限公司合成。DNA 片段純化試劑盒（DNA fragment purification kit）、DNA marker DL 1000、rTaq 酶和Goldview 等均購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3主要儀器 配有自動進(jìn)樣器、紫外檢測器、色譜工作站的 Agilent 1100 型高效液相色譜儀為美國 Agilent 公司產(chǎn)品；色譜柱為 Agilent Zorbax SB-C18 柱，柱溫為 35 ℃；流動相 A 為 95％ CH3OH 和 5％ CH2Cl2，B 為 5％ CH3OH和 95％ CH2Cl2；流速為 1.5 ml/min；UV 檢測波長為 260 nm；進(jìn)樣量為 20 μl；2400 型 PCR 擴(kuò)增儀為美國Applied Biosystems 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1菌株培養(yǎng) 將各菌株接種于改良羅氏培養(yǎng)基斜面上，根據(jù)其生長特征放置于適宜溫度進(jìn)行培養(yǎng)，快生長菌培養(yǎng) 1 周，慢生長菌培養(yǎng) 3 ～ 4 周。

1.2.2分枝菌酸的 HPLC 分析 具體操作參照文獻(xiàn)[3]。刮取生長良好且無污染的分枝桿菌培養(yǎng)物，經(jīng)皂化、提取、衍生、萃取等步驟獲得分枝菌酸樣品，然后濃縮至干燥。分析前用 CH2Cl2溶解樣品，并加入適量高分子量內(nèi)標(biāo)，用高效液相色譜儀進(jìn)行 MA 樣品的 HPLC 色譜圖分析。采用M. intracellulare 作為質(zhì)控菌種樣品；每 10 個樣品進(jìn)樣后，進(jìn)行一次 M. intracellulare 的分析，作為結(jié)果的控制指標(biāo)，以確保色譜、系統(tǒng)方法的有效性和準(zhǔn)確性。

1.2.316S rRNA 基因序列分析 具體操作參照文獻(xiàn)[4]。取生長良好且無污染的菌種培養(yǎng)物，經(jīng)細(xì)菌裂解、DNA 制備、PCR 擴(kuò)增以及 DNA 純化后，進(jìn)行上、下游測序，并將雙向結(jié)果拼接后得到最準(zhǔn)確序列。PCR 上游引物（位于分枝桿菌 16Sr RNA 基因的 62 ～ 85位核苷酸）為 5′ CACATGCA AGTCGAACGGAAAGG 3′，下游引物（位于分枝桿菌 16S rRNA 基因 626 ～ 647 位核苷酸）為 5′GCCCGTATCGCCCGCACGCT 3′，上下游引物擴(kuò)增16S rRNA 基因 5′ 端長度約 585 bp 的片段。

對所測定序列用 Clustalx 1.83 軟件進(jìn)行同源性多序列比對，并用鄰位相連法（neighbour joining，N-J 法）繪制 16S rRNA 基因序列聚類分析樹狀譜，使用 DNAStar 公司的 MegAlign 軟件計算相似性百分比。

2 結(jié)果

2.1 MA 的 RP-HPLC 分析

2.1.1MA 色譜圖的構(gòu)建 采用 RP-HPLC 法建立了《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中載入的 49 種分枝桿菌模式株的 MA 色譜圖，結(jié)果顯示不同分枝桿菌的 MA 色譜圖分別具有單簇峰（典型圖譜見圖 1）、雙簇峰（典型圖譜見圖 2）和三簇（含多簇）峰（典型圖譜見圖 3）三類特征（表 1）。

圖1 典型單簇峰譜圖Figure 1 Pattern single peak-cluster

2.1.2MA 的色譜圖分析 49 種分枝桿菌模式株中有 42 種可明確進(jìn)行鑒別，僅單簇峰中的牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌和胃分枝桿菌，雙簇峰中的愛知分枝桿菌和羅德島分枝桿菌，三簇峰中的南非分枝桿菌和母牛分枝桿菌這 7 種因各組內(nèi)相對保留時間（RRT）和相對峰高比均相似，采用RP-HPLC 法較難以進(jìn)行鑒別。

圖2 典型雙簇峰譜圖Figure 2 Pattern double peak-clusters

圖3 典型三簇峰譜圖Figure 3 Pattern triple peak-clusters

表1 49 種分枝桿菌模式株的分枝菌酸 HPLC 峰形分類表Table 1 HPLC chromatographic classification of mycolic acids of 49 kinds of mode strains ofMycobacterium

2.2 16S rRNA 序列分析

2.2.116S rRNA 基因的 PCR 擴(kuò)增 成功完成49 種分枝桿菌模式株 16S rRNA 基因的 PCR 擴(kuò)增，均得到一條約 585 bp 的 16S rRNA 5′ 端DNA 片段，與目的條帶大小相符。

2.2.216S rRNA 基因序列分析 通過同源性序列比對，繪制 16S rRNA 基因序列聚類分析樹狀譜，并計算菌株間相似百分比[4]。結(jié)果顯示：49 種分枝桿菌模式株中有 37 種可明確進(jìn)行鑒別，而產(chǎn)鼻疽分枝桿菌和塞內(nèi)加爾分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌和海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和胃分枝桿菌、龜亞分枝桿菌和龜膿分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群這 12 種因各組內(nèi)之間 16S rRNA 基因序列相似性百分比為 100％，難以進(jìn)行鑒別。

2.3 分枝菌酸 RP-HPLC 法和 16S rRNA 序列分析法對分枝桿菌分型鑒別的結(jié)果比較

2.3.116S rRNA 基因序列分析法無法鑒別的菌種

⑴16S rRNA 基因序列無法區(qū)分產(chǎn)鼻疽分枝桿菌和塞內(nèi)加爾分枝桿菌，采用分枝菌酸 RP-HPLC法則可對這兩種分枝桿菌加以鑒別。圖 4 可見，兩者均呈現(xiàn)出 9 個鋒，但其相對峰高比呈現(xiàn)差異，產(chǎn)鼻疽分枝桿菌的 6#峰高于 8#峰，而塞內(nèi)加爾分枝桿菌的 6#峰高約為 8#峰高的 1/2。

⑵16S rRNA 基因序列無法區(qū)分海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌，而采用分枝菌酸RP-HPLC法可對這兩種分枝桿菌加以明確鑒別。圖 5 可見，兩者均呈現(xiàn)出 8 個峰，但其 RRT 和相對峰高比均呈現(xiàn)明顯差異，海分枝桿菌色譜峰的 RRT（13.441 ～ 17.417 min）比潰瘍分枝桿菌色譜峰的 RRT（14.880 ～ 18.393 min）早出峰約 1.4 min；且海分枝桿菌的2#峰值最高，約為 3#峰的 1.5 倍，而潰瘍分枝桿菌的 2#峰卻要低于 3#峰。

⑶16S rRNA 基因序列無法區(qū)分堪薩斯分枝桿菌和胃分枝桿菌，與文獻(xiàn)[5-7]報道一致。而采用RP-HPLC 法可對這兩種分枝桿菌加以明確鑒別。圖 6 可見，堪薩斯分枝桿菌色譜峰的 RRT（15.018 ～ 18.630 min）比胃分枝桿菌色譜峰的 RRT（16.563 ～ 19.516 min）早出峰約 1.5 min。

⑷16S rRNA 基因序列無法區(qū)分龜分枝桿菌龜亞種和龜分枝桿菌膿腫亞種。采用 RP-HPLC 法可對這兩種分枝桿菌加以鑒別。圖 7 可見，兩者兩簇色譜峰的 RRT 幾近相同，但進(jìn)一步采用相對峰高比可進(jìn)行分型鑒別[8]，對于第一簇色譜峰，龜分枝桿菌龜亞種的 2#峰與 3#峰相當(dāng)，而龜分枝桿菌膿腫亞種的 2#峰高約為 3#峰高的 1/5。

圖4 產(chǎn)鼻疽分枝桿菌和塞內(nèi)加爾分枝桿菌色譜圖比較Figure 4 HPLC chromatograms ofM. farcinogenesandM. senegalens

圖5 海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌色譜圖比較Figure 5 HPLC chromatograms ofM. marinumandM. ulcerans

圖6 堪薩斯分枝桿菌和胃分枝桿菌色譜圖比較Figure 6 HPLC chromatograms ofM. kansasiiandM. gastri

⑸16S rRNA 基因序列無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌。Strain 等[9]研究認(rèn)為，結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌有著相同的 MA 組成，采用 RP-HPLC 也無法進(jìn)行鑒別，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致。圖 8 可見，結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的色譜圖極為相似，各峰 RRT 和峰高均較一致，故難以鑒別；田鼠分枝桿菌色譜峰的 RRT 與結(jié)核、牛分枝桿菌雖類似，但田鼠分枝桿菌的 3#峰值最高，而結(jié)核和牛分枝桿菌的 5#峰值最高，且峰值遠(yuǎn)高于 3#峰，故容易鑒別；非洲分枝桿菌的色譜圖與其他 3 種分枝桿菌的譜圖則明顯不同，能進(jìn)行明確鑒別。

2.3.2分枝菌酸 RP-HPLC 法無法鑒別的菌種

⑴RP-HPLC 無法鑒別具有單簇峰的結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。胃分枝桿菌色譜圖的相對峰高比雖與前兩者略有差異，但仍較難鑒別。采用 16S rRNA 基因序列分析法可見，結(jié)核和牛分枝桿菌的16S rRNA 基因序列的相似性為 100％，無法進(jìn)行鑒別；而胃分枝桿菌與前兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與結(jié)核分枝桿菌的相似性為 97.0％，很容易進(jìn)行鑒別。

⑵RP-HPLC 無法鑒別的具有雙簇峰的愛知分枝桿菌和羅德島分枝桿菌，采用 16S rRNA 基因序列分析法可見，愛知分枝桿菌和羅德島分枝桿菌盡管親緣關(guān)系很近，其 16S rRNA 基因序列的相似性為 99.7％，但可變區(qū)有 3 個位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，可以進(jìn)行鑒別。

⑶RP-HPLC 無法鑒別的具有三簇峰的南非分枝桿菌和母牛分枝桿菌，采用 16S rRNA 基因序列分析法可見，兩者盡管親緣關(guān)系很近，16S rRNA 基因序列的相似性為 99.8％，但可變區(qū)有兩個位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，可以進(jìn)行鑒別。

圖7 龜分枝桿菌龜亞種和龜分枝桿菌膿腫亞種色譜圖比較Figure 7 HPLC chromatograms ofM. chelonaesubsp. ChelonaeandM. chelonae subsp. Abscessus

3 討論

本研究分別采用分枝菌酸 RP-HPLC 法和16S rRNA 序列分析法對《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中載入的 49 種分枝桿菌模式株進(jìn)行分型鑒別。結(jié)果表明，分枝菌酸 RP-HPLC 分析法可將 42 種分枝桿菌進(jìn)行明確鑒別，而牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌和胃分枝桿菌，愛知分枝桿菌和羅德島分枝桿菌、南非分枝桿菌和母牛分枝桿菌這 7 種分枝桿菌因各組內(nèi)相對保留時間（RRT）和相對峰高比均相似，難以進(jìn)行鑒別；16S rRNA 基因序分析法可將37 種分枝桿菌進(jìn)行明確鑒別，而產(chǎn)鼻疽分枝桿菌和塞內(nèi)加爾分枝桿菌，潰瘍分枝桿菌和海分枝桿菌，堪薩斯分枝桿菌和胃分枝桿菌，龜亞分枝桿菌和龜膿分枝桿菌，結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌這 12 種分枝桿菌因各組內(nèi)之間 16S rRNA 基因序列相似性百分比為100％，難以進(jìn)行鑒別。兩種方法在分枝桿菌分型上雖存在一定的局限性，但兩者相互補(bǔ)充，可將除結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌以外的 47 種分枝桿菌準(zhǔn)確地鑒定到種的水平。

傳統(tǒng)分型法主要包括生長特征和生化特征的檢測，其中生長特征包括生長速度、色素產(chǎn)生、生長溫度以及培養(yǎng)基鑒別試驗(yàn)等，生化特征包括吐溫-80 水解試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、芳香硫酸脂酶試驗(yàn)、鐵離子吸收試驗(yàn)、亞碲酸鹽還原試驗(yàn)等[10]。分枝桿菌培養(yǎng)周期長，短則 1 周，長則 4 周以上。檢測結(jié)果依賴于生長狀態(tài)，容易受溫度、培養(yǎng)基、生化反應(yīng)試劑、技術(shù)人員操作水平等諸多因素的影響，結(jié)果分析通常比較困難。而 16S rRNA 基因序列分析法和分枝菌酸 RP-HPLC 法雖需借助較昂貴的儀器來完成，但檢測時間短，方法穩(wěn)定可靠，結(jié)果更準(zhǔn)確和有效。

隨著我國國力的迅速增強(qiáng)，大中型城市已日益具備開展 16S rRNA 基因序列分析和分枝菌酸RP-HPLC 檢測技術(shù)的條件。目前，在建立模式菌株信息庫的基礎(chǔ)上，還需收集大量的臨床分離分枝桿菌進(jìn)行進(jìn)一步的完善，以期開發(fā)一種能進(jìn)行分枝桿菌分型的軟件系統(tǒng)，填補(bǔ)我國在該領(lǐng)域的空白。

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Identification of Mycobacterium species by reversed phase high performance liquid chromatography and 16S rRNA sequence analysis

CHEN Bao-wen, DU Wei-xin, DU Rong, YAN Li-xia, GUO Lei, YANG Lei, WANG Guo-zhi

ObjectiveTo compare the reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and 16S rRNA sequence analysis for the identification of Mycobacterium species.Methods49 Mycobacterium species which recorded in ‘Bergey’s manual of systematic bacteriology’ were inoculated in Lowenstein cultured medium. Mycolic acids from each culture of Mycobacterium species were extracted, saponified, acided, derivatized and analyzed by the RP-HPLC and a mycobacteria mycolic acids fingerprints library of HPLC patterns was constructed. The DNA of each culture of Mycobacterium species was also amplified by PCR and purified for the identification by 16S rRNA sequencing.ResultsAmong 49 Mycobacterium mode strains, 7 kinds of strains, which included single-cluster peak of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis and Mycobacterium gastri, double-cluster peaks of Mycobacterium aichiense and Mycobacterium rhodesiae, and triple-cluster peaks of Mycobacterium austroafricanum and cMycobacterium vaccae, were difficult to be identified because of the similarity of relative retention time and relative peak height ratio using RP-HPLC. Using analysis of 16S rRNA sequence analysis, 12 kinds of strains, which included Mycobacterium farcinogenes and Mycobacterium senegalense,Mycobacterium ulcerans and Mycobacterium marinum, Mycobacterium kansasii and Mycobacterium gastri, Mycobacterium chelonae subsp. Chelonae and Mycobacterium chelonae subsp. Abscessus, and Mycobacterium tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti and M. africanum), were difficult to be identified because of the same gene sequences. Using the two complementary methods, 47 of the 49 Mycobacterium species could be clearly identified except M. tuberculosis and M. bovis.ConclusionThe combination of RP-HPLC and 16S rRNA sequence analysis provides an accurate and efficient technique for Mycobacterium identification. With these two complementary methods, most of the Mycobacterium species can be well distinguished and identified.

Mycobacterium; Mycolic acids; Chromatography, high pressure liquid; Bacterial typing techniques; Sequence analysis, DNA; 16S rRNA

WANG Guo-zhi, Email: tbtestlab@163.net

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.0?03

重大傳染病診斷產(chǎn)品質(zhì)量評價綜合技術(shù)平臺（2009ZX10004-805）

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院（陳保文、都偉欣、閆李俠、楊蕾、王國治）；100850 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所（杜蓉、郭磊）

王國治，Email：tbtestlab@163.net

2012-03-05

方法將《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中載入的 49 種分枝桿菌模式株接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，置于最適溫度下孵育。挑取生長良好且無污染的培養(yǎng)物，一部分經(jīng)皂化和酸化提取分枝菌酸并衍生后，采用反相高效液相色譜法進(jìn)行分枝菌酸指紋圖譜構(gòu)建；另一部分經(jīng)裂解和 PCR 擴(kuò)增，獲得 DNA，純化后，采用核酸分析儀進(jìn)行 16S rRNA 序列測定。

結(jié)果49 種分枝桿菌模式株中，采用 RP-HPLC 分析時，單簇峰的結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和胃分枝桿菌，雙簇峰的愛知分枝桿菌和羅德島分枝桿菌，三簇峰的南非分枝桿菌和母牛分枝桿菌共 7 種因各組內(nèi)相對保留時間和相對峰高比值相近而難以進(jìn)行鑒別；采用 16S rRNA 序列分析法分析時，產(chǎn)鼻疽分枝桿菌和塞內(nèi)加爾分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌和海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和胃分枝桿菌、龜亞分枝桿菌和龜膿分枝桿菌以及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌和非洲分枝桿菌）共 12 種因各組內(nèi)基因序列相似性百分比為 100％ 而難以進(jìn)行鑒別。通過兩種分型鑒別方法的比較，可見除結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌外，兩種分型方法相互補(bǔ)充，可將 49 種分枝桿菌模式株中的 47 種進(jìn)行明確鑒別。

結(jié)論分枝菌酸 RP-HPLC 和 16S rRNA 序列分析法均為分枝桿菌的分型鑒定提供了準(zhǔn)確和有效的技術(shù)方法。兩種方法相互借鑒能準(zhǔn)確地將大多數(shù)分枝桿菌鑒定到種。

Author Affiliations:National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China (CHEN Bao-wen, DU Wei-xin, YAN Li-xia, YANG Lei, WANG Guo-zhi); Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology, Beijing 100850, China (DU Rong, GUO Lei)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(4):263-269