富巖，尹麗莉，顧靜良，馬憲梅，左從林，于在林

·論著·

重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白的藥效學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)研究

富巖*，尹麗莉*，顧靜良，馬憲梅，左從林，于在林

目的對(duì)重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白（rHSA/GCSF）開展藥效學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)動(dòng)物評(píng)價(jià)研究，以確認(rèn)其安全性和有效性。

血清白蛋白； 粒細(xì)胞集落刺激因子； 藥理學(xué)； 毒理學(xué)； 融合蛋白

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(4):241-256

重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF）的應(yīng)用已成為腫瘤治療的重要支持手段之一。rhG-CSF 可以減少化療后中性粒細(xì)胞減少性發(fā)熱的發(fā)生率，從而降低醫(yī)療費(fèi)用，改善患者的生活質(zhì)量。同時(shí) rhG-CSF 的應(yīng)用不僅可以保證常規(guī)化療如期足量進(jìn)行，而且使患者能耐受提高劑量強(qiáng)度的化療或劑量密集性化療，還用于高劑量化療聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植的干細(xì)胞動(dòng)員與移植后造血重建，從而保證甚至提高化療的療效[1-2]。作為一種蛋白質(zhì)類藥物，rhG-CSF 的半衰期短，需要每日注射1 ～ 2 次，給治療帶來(lái)了不便。人血清白蛋白（HSA）結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，它在血管和血管外循環(huán)中分布較廣，半衰期較長(zhǎng)，是血液中重要的運(yùn)輸載體，因此也成為改善藥物半衰期的載體蛋白。重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白（rHSA/GCSF）是將 hGCSF基因的 N 端直接融合到人血清白蛋白基因的 C 端而形成的融合蛋白，與 rhG-CSF 相比有更長(zhǎng)的血液半衰期，在臨床使用中可以降低給藥頻率，減少患者痛苦，提高治療的順應(yīng)性。

Halpern 等[3]報(bào)道了由酵母菌 S. ceravenia 表達(dá)制備的重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白（AlbugraninTM）在小鼠和獼猴中的藥代動(dòng)力學(xué)初步研究結(jié)果并給予了成藥性的提示。同時(shí)，富巖等[4]開展了由酵母菌 P. pastoris 表達(dá)制備的重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白新藥的詳盡和全面的藥學(xué)研究。本試驗(yàn)?zāi)康氖强疾靣HSA/GCSF 融合蛋白在保持 GCSF 生物學(xué)作用的同時(shí)，是否延長(zhǎng)了 GCSF 的生物半衰期，是否可用于腫瘤患者化療或放療后的中性粒細(xì)胞減少癥的治療。為認(rèn)識(shí)該新藥的藥理毒理學(xué)特點(diǎn)，結(jié)合國(guó)家有關(guān)新藥的法規(guī)及該融合蛋白的特點(diǎn)進(jìn)一步開展了系統(tǒng)的臨床前藥效學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)以及藥代/毒代的完整安全性動(dòng)物評(píng)價(jià)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠（SPF 級(jí)）460 只、Beagle 狗 12 只（普通級(jí)）、Wistar 大鼠（SPF 級(jí)）183 只、食蟹猴（普通級(jí)）77 只、恒河猴 1 只分別購(gòu)自于中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心、福州振和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)開發(fā)有限公司、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所、廣西新豐源生物科技有限公司以及軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（北京）。本實(shí)驗(yàn)涉及的所有動(dòng)物處理內(nèi)容均遵從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理和動(dòng)物福利相關(guān)條例和法規(guī)，并由北京昭衍新藥研究中心有限公司的動(dòng)物倫理委員會(huì)（IACUU）批準(zhǔn)和監(jiān)督執(zhí)行。研究者已努力做到最大可能地減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用數(shù)量。

1.1.2供試品、試劑及檢測(cè)試劑盒 注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白凍干粉針劑由天津溥瀛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為 9314/20080502，規(guī)格為 1.5 mg/ml/支；批號(hào)為9314/20080503，規(guī)格為 1 mg/ml/支；陽(yáng)性對(duì)照藥重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液（惠爾血）由日本麒麟啤酒株式會(huì)社原液制造，麒麟鯤鵬（中國(guó)）生物藥業(yè)有限公司制劑生產(chǎn)，批號(hào)為 20080651，規(guī)格為 300 μg/1.2 ml/支?；熕幬锓蜞奏ぷ⑸湟海?-Fu）由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為0803112，標(biāo)示量為 0.25 g/10 ml/支。其他試劑為藥用級(jí)、分析級(jí)純度；主要檢測(cè)試劑盒 Human G-CSF Instant ELISA 由丹麥 Bender MedSystems GmbH公司制造。

1.1.3儀器 美國(guó) Biopac 公司的 MP150 多導(dǎo)生理記錄儀；美國(guó) Bayer 公司的 Bayer Advia 2120全自動(dòng)血球分析儀；日本東芝公司的 TBA-120FR型全自動(dòng)生化分析儀；美國(guó) Medica 公司的Easylyte 型全自動(dòng)電解質(zhì)分析儀；高效液相色譜儀SHIMADZU 10AT 為日本島津公司產(chǎn)品；TSK G3000 SWxl 300A，10 μ，7.8 × 300 mm 的凝膠柱購(gòu)自日本 TOSOH 公司；酶標(biāo)儀為美國(guó) Bio-Rad公司或 Thermo Multiskan MK3 酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1藥效學(xué)研究

1.2.1.1體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn) 取體重 5 ～ 6 kg 恒河猴，經(jīng)戊巴比妥鈉靜脈麻醉，用 16 號(hào)骨髓穿刺針在髂后上脊處取骨髓細(xì)胞液 5 ml，注入含 EDTA的抗凝真空管中，混勻后 1800 × g 離心 10 min；棄上清，用 5 ml IMDM 重新溶解懸浮細(xì)胞，加入5 ml 淋巴細(xì)胞分層液，再次離心 20 min，取中層有核細(xì)胞用 PBS 溶液洗滌 2 遍，用 6 ml IMDM重新懸浮，稀釋至（3 ～ 4）× 106個(gè)/ml 待用。實(shí)驗(yàn)組加入 125 μl 不同濃度的 rHSA/GCSF（2.4、12、60、300、1500 μg/ml）；陽(yáng)性組加入 12 μl 陽(yáng)性對(duì)照藥（10 μg/ml）；陰性對(duì)照組加入 12 μl PBS，各組配制 3 ml 的培養(yǎng)體積，混勻，在 24 孔板中加入 0.5 ml 體系培養(yǎng)，每組重復(fù) 4 孔。放入 37 ℃，飽和濕度 5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 ～ 10 d 后于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)集落，多于 50 個(gè)細(xì)胞判讀為一個(gè)集落。

1.2.1.2小鼠放療和化療實(shí)驗(yàn) 140 只小鼠，隨機(jī)分為 7 組，每組 20 只，分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，rHSA/GCSF 4 個(gè)劑量組（500、150、50 和 15 μg/ml）和陽(yáng)性對(duì)照組（惠爾血 5 μg/ml）；陰性對(duì)照為 0.9％ 氯化鈉注射液，給藥途徑為皮下注射，給藥容量為 0.1 ml/10g。除正常對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物按 150 mg/kg 給予 5-Fu，給藥途徑為靜脈注射，給藥容量為 0.1 ml/10g。給予化療藥24 h 后分別于第 1（給予 5-Fu 后的 24 h）、5、9 天給予受試藥，第 1 ～ 12 天每天給予陽(yáng)性對(duì)照藥。

放療實(shí)驗(yàn)則是在除正常對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物于第 1 天接受 5.0 Gy（劑量率約為 1.4 Gy/min）60Coγ 照射，并于當(dāng)天給予受試藥及陽(yáng)性對(duì)照藥，第 5、9、13、17 天給予受試藥 rHSA/GCSF；第1 ～ 20 天每天給予陽(yáng)性對(duì)照藥。

兩個(gè)實(shí)驗(yàn)給藥后每日觀察動(dòng)物的一般生理指標(biāo)，包括動(dòng)物的精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、進(jìn)食、飲水、發(fā)病、死亡等癥狀。記錄異常癥狀出現(xiàn)的時(shí)間、發(fā)展和緩解情況。放療于照射前及第 3 天、第 5 天、第 7 ～ 20 天檢測(cè)動(dòng)物的血液學(xué)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）。每次每組取血 10 只動(dòng)物，間隔進(jìn)行?；焺t是在給藥前及給藥后第 3、5、7、8、9、10、11、12、13 天檢測(cè)動(dòng)物的血液學(xué)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)。每次每組取血?jiǎng)游?10 只，間隔進(jìn)行?；煹?13 天，放療第21 天對(duì)全部動(dòng)物實(shí)施安樂死，取脾臟并稱重，計(jì)算脾臟相對(duì)于體重的相對(duì)重量，即臟器系數(shù)（脾重量/體重 × 100％），比較給藥組與模型對(duì)照組的差異。同時(shí)取動(dòng)物股骨骨髓，用中性福爾馬林固定，脫鈣后制石蠟切片，HE 染色，觀察骨髓造血情況。

血細(xì)胞計(jì)數(shù)、脾臟器重量/臟器系數(shù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用 t 檢驗(yàn)比較給藥組和同期模型對(duì)照組的差異，判定給藥的治療效果。

1.2.1.3食蟹猴藥效學(xué)研究 30 只食蟹猴，隨機(jī)分為 6 組，每組 5 只，分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組和3 個(gè)劑量的供試品組。供試品給藥濃度為 600、200、60 μg/ml；陽(yáng)性對(duì)照品濃度為 40 μg/ml；陰性對(duì)照品為 0.9％ 氯化鈉注射液。除正常對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物于第 1 天接受 3.0 Gy（劑量率約為 1.4 Gy/min）60Coγ 照射，照射前 1 日給予每只動(dòng)物慶大霉素 8 萬(wàn)單位，預(yù)防胃腸道癥狀，并于照射當(dāng)天（照射后 5 h內(nèi)）給予 rHSA/GCSF 或陽(yáng)性對(duì)照品。第 1、5、9、13、17、21 天給予供試品；第 1 ～ 24 天每天給予陽(yáng)性對(duì)照品。給藥途徑為皮下注射，給藥容量為 0.25 ml/kg。臨床觀察指標(biāo)有一般生理指標(biāo)、體重、外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)。骨髓細(xì)胞培養(yǎng)（體外藥效學(xué)研究）、骨髓細(xì)胞涂片觀察、病理組織學(xué)檢查等。

1.2.2安全藥理

1.2.2.1小鼠安全藥理研究 單次皮下給藥rHSA/ GCSF 的安全藥理試驗(yàn)考察是在 SPF 級(jí)昆明小鼠中開展的。實(shí)際使用 80 只小鼠，雌雄各半（由于交叉設(shè)計(jì)，得到 120 只小鼠的數(shù)據(jù)）。用 1 ml 一次性無(wú)菌無(wú)熱原注射器準(zhǔn)確抽取藥物后，于動(dòng)物頸背部皮下給藥。3 個(gè) rHSA/GCSF 劑量組分別為 500、1500 和 3000 μg/kg。將動(dòng)物按上述分組為供試品組和生理鹽水陰性對(duì)照組，每組 10 只（雌雄各半）。直接觀察給藥后動(dòng)物一般行為表現(xiàn)、姿勢(shì)、步態(tài)、流涎、肌顫及瞳孔變化?？疾鞂?duì)正常小鼠自主活動(dòng)的影響：上述動(dòng)物于給藥后第 6 小時(shí)和第 24 小時(shí)分別測(cè)試 10 min 內(nèi)各組小鼠自主活動(dòng)數(shù)，比較組間結(jié)果。對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響則是將動(dòng)物按上述分組給藥，于給藥后 6 h，分別腹腔注射 0.3％ 戊巴比妥鈉（30 mg/kg），觀察 30 min 內(nèi)睡眠情況，如有動(dòng)物出現(xiàn)翻正反射消失，需記錄出現(xiàn)的動(dòng)物數(shù)及出現(xiàn)睡眠時(shí)間、睡眠消失時(shí)間。對(duì)正常小鼠攀網(wǎng)能力的影響考察是把金屬網(wǎng)呈 45° 置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，將動(dòng)物按上述分組用藥后 370 min、24 h的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，將實(shí)驗(yàn)小鼠每次每組 1 只放于網(wǎng)上任其攀爬，觀察 10 min 內(nèi)各組落下的小鼠只數(shù)。

1.2.2.2對(duì)狗心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的安全藥理研究 取 12 只 Beagle 狗，按性別分為兩個(gè)區(qū)段后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組 2 組，每組 6 只動(dòng)物，雌雄各半，體重雌性為 6.51 ～ 8.26 kg，雄性為6.54 ～ 8.62 kg。對(duì)照組動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)束后，間隔 7 d消除期，用于低劑量組試驗(yàn)。將動(dòng)物用 35 mg/kg 的戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉后固定。氣管及股動(dòng)脈插管，連接呼吸傳感器、血壓傳感器及心電極。待角膜反射消失、四肢及腹部肌肉松弛、呼吸平穩(wěn)認(rèn)為麻醉適度。記錄動(dòng)物各項(xiàng)指標(biāo)藥前值后，用一次性無(wú)菌無(wú)熱原注射器準(zhǔn)確抽取藥物后，于動(dòng)物后肢內(nèi)側(cè)皮下多點(diǎn)注射給藥，每點(diǎn)注射量約 2 ml。rHSA/ GCSF 給藥劑量分別為 0、50、200 μg/kg。觀察記錄對(duì)照組及給藥組給藥即刻、15、30、60、90、120、150 min 血壓、心電、心率、心律的變化及呼吸頻率和潮氣量等各項(xiàng)指標(biāo)的變化。

1.2.3安全性評(píng)價(jià)

1.2.3.1急性毒性實(shí)驗(yàn)

⑴小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn) 采用區(qū)段隨機(jī)分組法，將小鼠先按性別分成雌雄兩個(gè)區(qū)段，然后根據(jù)每個(gè)區(qū)段的動(dòng)物數(shù)、臨時(shí)編號(hào)和標(biāo)記，用 Excel 軟件給出隨機(jī)號(hào)，使隨機(jī)號(hào)與動(dòng)物號(hào)對(duì)應(yīng)。然后將隨機(jī)號(hào)從小到大進(jìn)行排序，按照隨機(jī)號(hào)的大小將動(dòng)物分組。給藥體積為 0.25 ml/10g。采用一次性無(wú)菌注射器準(zhǔn)確抽取所需藥液，皮下注射給藥組注射部位為動(dòng)物的頸背部皮膚。靜脈注射給藥組采用尾靜脈注射，注射速度約為 0.5 ml/10 秒；對(duì)照組尾靜脈注射相應(yīng)量的生理鹽水。將動(dòng)物分組后，按靜脈注射對(duì)照組，皮下注射給藥組，靜脈注射給藥組的順序給藥。給藥后連續(xù)觀察 4 h，以后每天上下午各觀察記錄 1 次，共觀察14 d。給藥后開展一般生理指標(biāo)觀察、體重、食量考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射戊巴比妥鈉 50 mg/kg 麻醉動(dòng)物，待動(dòng)物進(jìn)入無(wú)意識(shí)狀態(tài)后，通過(guò)股動(dòng)脈放血法，將動(dòng)物安樂死后均進(jìn)行大體解剖，大體解剖觀察到有異常的器官則要做組織病理學(xué)檢查。試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)不同組別動(dòng)物的體重和食量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。體重、食量數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間進(jìn)行成組 t 檢驗(yàn)。單次給藥的毒性試驗(yàn)結(jié)果以 MTD 表示，如未見動(dòng)物死亡，則 MTD 大于等于該給藥劑量。

⑵食蟹猴急性毒性實(shí)驗(yàn) 取食蟹猴 3 只，1 雌（2.16 kg）2 雄（2.11 和 2.33 kg），給藥劑量分別為 2.3、5.2 和 11.6 mg/kg。給藥途經(jīng)為皮下注射（雙后肢皮下注射給藥）。多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射量不超過(guò) 3 ml。檢測(cè)指標(biāo)主要有臨床觀察、體溫、體重、食量、心電圖、經(jīng)全自動(dòng)血球分析儀開展各種血細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血功能指標(biāo)、血生化檢查、尿常規(guī)檢查、骨髓切片檢查、病理檢查；組織病理檢查則是在動(dòng)物安樂死后觀察所有動(dòng)物組織，如果有異常則紀(jì)錄并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。將動(dòng)物給藥前后的體重、體溫、心電圖、血液學(xué)、血液生化等指標(biāo)直接進(jìn)行比較，綜合評(píng)價(jià)。

1.2.3.2長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)

⑴大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn) 將 160 只 Wistar 大鼠（SPF級(jí)）按 1.2.3.1⑴ 中的分組方法將動(dòng)物分為 4 組。給藥途經(jīng)為頸背部皮下，3 個(gè)供試劑量分別為 5000、1200 和 300 μg/kg，空白對(duì)照組給藥生理鹽水。給藥的頻率及周期為每 4 天給藥1 次，連續(xù)給藥 13 周，共給藥 23 次。試驗(yàn)觀察主要有一般臨床觀察、注射部位觀察和每周 1 次的詳細(xì)體檢；體重、體溫、食量觀察，血液學(xué)指標(biāo)主要有血細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血功能、血液生化指標(biāo)檢查；尿常規(guī)、眼科檢查、抗體檢查和中和抗體測(cè)定；臟器重量和臟器系數(shù)組織學(xué)和器官檢查則在給藥4 周、末次給藥后 2 d 及停藥 4 周后，分別安樂死部分試驗(yàn)動(dòng)物檢查肝臟、脾臟、肺臟、給藥局部和胸骨骨髓、股骨骨髓、跖骨和踝關(guān)節(jié)。給藥 4 周即第 8 次給藥后 2 d，每組安樂死動(dòng)物數(shù)雌雄各5 只；末次藥后 2 天，每組安樂死的動(dòng)物數(shù)雌雄各 10 只。停藥后剩余動(dòng)物繼續(xù)觀察 4 周（恢復(fù)期），以便了解毒性反應(yīng)的恢復(fù)情況和可能出現(xiàn)的延遲性毒性，恢復(fù)期結(jié)束后將動(dòng)物實(shí)施安樂死。

試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析主要有：計(jì)算各組動(dòng)物的體重、體重增長(zhǎng)量（率）、體溫、血液學(xué)、凝血功能指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、器官重量和臟器系數(shù)等指標(biāo)的組平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。這些數(shù)據(jù)用 Levene’s 檢驗(yàn)方差齊性。如果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如果ANOVA 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ≤ 0.05），用 Dunnett’s test 進(jìn)行比較分析；如果方差不齊（P ≤ 0.05），則用 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。如果 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ≤ 0.05），則用 Mann-Whitney 法進(jìn)行均數(shù)間的兩兩比較。分析數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義時(shí)，如有必要分析給藥前后的指標(biāo)變化，統(tǒng)計(jì)方法采用配對(duì) t 檢驗(yàn)。

⑵食蟹猴長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn) 試驗(yàn)動(dòng)物分組方法與大鼠長(zhǎng)毒試驗(yàn)分組方法相同。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24 只，分為 4 組：陰性對(duì)照組、供試品低劑量組（30 μg/kg）、中劑量組（150 μg/kg）和高劑量組（750 μg/kg），每組 6 只，雌雄各半。注射部位為雙后肢內(nèi)側(cè)皮膚，進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射，每點(diǎn)注射量不超過(guò) 2 ml，給藥容量 0.5 ml/kg，給藥頻率及周期為每周給藥1 次，共給藥 9 次。臨床考察指標(biāo)和所有內(nèi)容與大鼠長(zhǎng)毒試驗(yàn)中考察內(nèi)容和指標(biāo)相同。為檢測(cè)受試動(dòng)物體內(nèi)是否產(chǎn)生抗 rHSA/GCSF 的抗體，則是以rHSA/GCSF 蛋白質(zhì)包被自制 ELISA 96 孔板，計(jì)算對(duì)照組動(dòng)物或陰性對(duì)照組最低稀釋度血清 OD值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算x± 2s 值，當(dāng)樣品 OD值為 0.1 以上，且樣品 OD 值 ＞ ODx± 2s時(shí)判斷為抗體陽(yáng)性。通常對(duì)照組動(dòng)物或陰性對(duì)照組血清稀釋度為 1∶100 時(shí)的 OD 值在 0.2 以內(nèi)時(shí)，認(rèn)為系統(tǒng)可靠。決定檢測(cè)到的受試動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體是否是中和抗體，則是將血清樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，直接開展 NFS-60 細(xì)胞 MTT 比色法測(cè)定生物學(xué)活性。

1.2.4藥代/毒代評(píng)價(jià)

1.2.4.1非臨床藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)125I-rHSA/GCSF在昆明小鼠和 Wistar 大鼠中的分布及代謝動(dòng)力學(xué)研究是將125I 標(biāo)記后的125I-rHSA/GCSF 及未標(biāo)記的rHSA/GCSF混合，用注射用水配制至 300 μg/m（l大鼠用，共約 6 ml）和60 μg/m（l小鼠用，共約 6 ml）。將標(biāo)記后的125I-rHSA/GCSF 進(jìn)行生物活性測(cè)定。

試驗(yàn)開始前進(jìn)行了方法學(xué)確認(rèn)試驗(yàn)。取 6 只小鼠，3％ 戊巴比妥鈉麻醉后，取腦、肌肉、生殖腺、淋巴結(jié)、小腸、脾、腎、肝、肺、心、甲狀腺、血清、尿等 13 種器官/組織或體液，加入緩沖液，制成勻漿，加入 5 個(gè)不同梯度放射性的125I-rHSA/ GCSF[分別為 102、103、104、105、106cpm（count per minute）；等同于（eqv）1200、120、12、1.2、0.12 ng]，樣本混勻后，測(cè)定總放射性，而后加入等體積 20％ TCA 沉淀蛋白（使其終濃度為 10％），離心后去除上清，測(cè)定沉淀部分放射性。并對(duì)方法的特異性、靈敏度及可靠定量下限、線性、精密度和回收率等進(jìn)行考察。

組織分布測(cè)定：取 24 只小鼠，皮下注射125I-rHSA/GCSF，每只0.2 ml（12 μg/只），分別于注射后 4、24、72 和 168 h 麻醉動(dòng)物，股靜脈放血安樂死 6 只（雌雄各半），取甲狀腺、心臟、肺臟、肝、脾、腎上腺、腎、膀胱、生殖腺、注射局部淋巴結(jié)、腸淋巴結(jié)、腸內(nèi)容物、腸內(nèi)糞、小腸、脂肪、肌肉、骨髓（股骨）、腦、眼球、胰腺、胸腺、頜下腺、血清、尿等組織或體液。體液用精密移液器計(jì)量，組織用感量 0.1 mg 的電子天平稱濕重，制成勻漿，測(cè)定總放射性，而后加入等量 20％ TCA 沉淀蛋白，離心后去除上清，測(cè)定沉淀部分放射性。以 μg 當(dāng)量/g 組織新鮮濕重或體積（ml）表示放射性濃度。

血藥濃度測(cè)定：取 12 只 Wistar 大鼠，分為皮下注射組和靜脈注射組，按各自給藥途徑給予125I-rHSA/GCSF 0.2 ml/只（60 μg /只）。皮下組于注射后 1、3、8、10、24、48、72、96、120、168 h 眶靜脈取血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 6 只大鼠；靜脈組于給藥后 2 min、15 min、1、4、8、24、48、72、96、168 h 眶靜脈取血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 6 只大鼠。離心分離血清，測(cè)定總放射性，加入等體積的 20％ TCA沉淀蛋白，離心后去除上清，測(cè)定沉淀部分放射性，并計(jì)算血藥濃度。

糞尿排泄：取 5 只 Wistar 大鼠，每只皮下注射 0.2 ml（60 μg）的125I-rHSA/GCSF 藥液，單獨(dú)飼養(yǎng)在代謝籠內(nèi)。于注射后第 1、2、3、4、5、6、7、8、9 d 分別收集尿和糞，測(cè)定放射性，計(jì)算排出放射性占注入放射性量的百分比。

膽汁排泄：取 6 只 Wistar 大鼠，用 3％ 戊巴比妥鈉麻醉，切開腹腔，分離膽總管，遠(yuǎn)端結(jié)扎，近端插入引流管引流膽汁，待大鼠清醒后皮下注射125I-rHSA/GCSF，每只0.2 ml（6 μg），每小時(shí)收集1 次膽汁，收集 8 h。測(cè)定放射性，計(jì)算排出放射性占注入放射性量的百分比。

血漿蛋白結(jié)合率：取正常大鼠血漿，每管200 μl，分別加入125I-rHSA/GCSF，使血漿藥物濃度分別為 30、300 和 3000 ng/ml。37 ℃ 水浴 30 min后，用分子排阻 HPLC 法檢測(cè)125I-rHSA/GCSF 與血漿蛋白結(jié)合情況，并計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率。

部分血清、膽汁、尿液樣品的 SEC-HPLC 分析：考察樣品中125I-rHSA/GCSF 原型及代謝物的存在、生成情況。SEC-HPLC 色譜方法條件為：島津高壓泵，TSK G3000 SWxl 凝膠柱，300A，10 μ，7.8 × 300 mm。洗脫液：0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含 0.4 mol/L NaCl，pH 7.0，流速 1 ml/min。自動(dòng)部分收集器收集洗脫液體，測(cè)定每管放射性，origin 軟件作圖。

參數(shù)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析：使用 WinNolin Version5.2 按照非房室模型法（NCA）計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)，采用均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），以及變異系數(shù)（CV％）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。

1.2.4.2食蟹猴藥代/毒代評(píng)價(jià) 藥代評(píng)價(jià)采用s.c. 給藥 5、15、50 μg/kg 的 3 個(gè)劑量組，低劑量組兼作反復(fù)給藥組，i.v. 給藥組（15 μg/kg）和對(duì)照組 15 μg/kg（rhG-CSF），每組 4 只食蟹猴。毒代則結(jié)合食蟹猴長(zhǎng)毒試驗(yàn) 3 個(gè)劑量組[見1.2.3.2 （2）]，并于首次和第 8 次給藥前和給藥后的 4、8、10、24、48、72、96、120、168 h 分別取血開展毒代動(dòng)力學(xué)研究。取血部位均為后肢皮下靜脈，每次采血量約 1.0 ml。所獲血清樣品還開展結(jié)合抗體、中和抗體檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 藥效學(xué)研究

2.1.1體外藥效學(xué)研究 以猴骨髓細(xì)胞為研究系統(tǒng)，在體外條件下培養(yǎng)骨髓粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落，計(jì)數(shù)不同濃度的供試品對(duì) CFU-GM 數(shù)的影響。培養(yǎng) 8 d，各組體系內(nèi)均有不同數(shù)量的 CFU-GM 集落生成，rHSA/GCSF 濃度在 100 ng/ml ～ 62.5 μg/ml范圍內(nèi)，促進(jìn) CFU-GM 生成作用，并且在一定劑量下有劑量反應(yīng)關(guān)系。在 2.5 μg/ml 以上劑量時(shí)量效關(guān)系不明顯。陰性對(duì)照組集落數(shù)較少。試驗(yàn)結(jié)果見表 1。

2.1.2小鼠白細(xì)胞低下的療效 在小鼠化療模型中，檢定了氟尿嘧啶注射液（5-Fu）所致的小鼠白細(xì)胞減少癥的治療作用。與模型對(duì)照組比較，各給藥組均顯示了升高白細(xì)胞作用，主要是升高中性粒細(xì)胞。對(duì)外周血紅細(xì)胞和血小板未見明顯的影響。骨髓組織學(xué)檢查可見骨髓粒系造血細(xì)胞及成熟中性粒細(xì)胞增多（圖 1）。由此可見，rHSA/GCSF 具有治療氟尿嘧啶所致的小鼠白細(xì)胞減少癥的作用，可見一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，并且具有長(zhǎng)效作用，其單次注射與市售的普通 rhG-CSF 多次注射的作用有可比性。

60Coγ 射線照射放療所致的小鼠白細(xì)胞減少癥模型的結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，各給藥組均顯示了升高白細(xì)胞作用，主要是升高中性粒細(xì)胞。對(duì)外周血紅細(xì)胞、血小板未見明顯影響。給藥動(dòng)物脾增大，骨髓組織學(xué)檢查可見骨髓粒系造血細(xì)胞及成熟中性粒細(xì)胞增多（圖 2）。由此可見，rHSA/ GCSF 具有治療60Coγ 照射所致的小鼠白細(xì)胞減少癥的作用，可見一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，并且具有長(zhǎng)效作用，其單次注射與市售的普通 rhG-CSF 多次注射的作用有可比性。

2.1.3食蟹猴白細(xì)胞低下的療效 結(jié)果顯示，各給藥組及陽(yáng)性對(duì)照組具有明顯的升高白細(xì)胞作用（圖 3），特別是升高中性粒細(xì)胞。同時(shí)對(duì)紅細(xì)胞、血小板未見明顯影響。骨髓粒系集落培養(yǎng)結(jié)果顯示，給藥組粒系集落明顯增多，骨髓粒系增生活躍，照射后 42 d，骨髓細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果顯示中高劑量給藥組部分動(dòng)物出現(xiàn)粒系增生明顯活躍，其他給藥組動(dòng)物、陽(yáng)性對(duì)照組及模型組動(dòng)物骨髓細(xì)胞學(xué)比例基本正常，各組動(dòng)物細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常。病理檢查結(jié)果顯示，各組均有部分動(dòng)物出現(xiàn)了骨髓粒系造血細(xì)胞增多，高劑量組有 2 只動(dòng)物出現(xiàn)了肝臟中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，陽(yáng)性對(duì)照組 1 只動(dòng)物腹股溝淋巴結(jié)髓質(zhì)淋巴竇內(nèi)可見粒系造血細(xì)胞。脾臟未見異常改變。說(shuō)明 rHSA/GCSF 在劑量為 15、50 和150 μg/kg 時(shí)，每 4 天注射 1 次，對(duì)60Coγ 照射所致的猴外周血白細(xì)胞減少癥具有治療作用，與市售普通 rhG-CSF 每天注射 1 次具有可比性。

表1 rHSA/GCSF 對(duì)骨髓 CFU-GM 集落形成的影響Table 1 rHSA/GCSF stimulating function on bone marrow forming CFU-GM

圖1 rHSA/GCSF 對(duì) 5-Fu 化療小鼠 WBC 影響的變化趨勢(shì)圖Figure 1 The effect of rHSA/GCSF on peripheral WBC of mice after treated with 5-Fu

2.2 安全藥理

2.2.1小鼠安全藥理試驗(yàn) 給藥后，供試品組動(dòng)物一般行為活動(dòng)好，未見異常姿勢(shì)、步態(tài)，無(wú)流涎、肌顫等現(xiàn)象發(fā)生，瞳孔無(wú)改變，觀察時(shí)間內(nèi)未見其他異常。rHSA/GCSF 組與生理鹽水陰性對(duì)照組對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響比較未見明顯差異，由此認(rèn)為給藥對(duì)小鼠的自主活動(dòng)沒有影響。rHSA/GCSF 對(duì)小鼠睡眠情況影響試驗(yàn)中，給藥組對(duì)戊巴比妥鈉引起的翻正反射消失數(shù)、入睡時(shí)間及睡眠持續(xù)時(shí)間與生理鹽水陰性對(duì)照組比較未見明顯差別。

2.2.2狗安全藥理試驗(yàn) 對(duì)狗一般狀況的影響試驗(yàn)過(guò)程中，狗均處于比較穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)，角膜反射消失，四肢及腹部肌肉松弛，呼吸深大且平穩(wěn)。對(duì)狗心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的影響心電圖指標(biāo)：給藥后各給藥組動(dòng)物心電圖各參數(shù)值（心率、QRS 間期、QRS 電壓、Q-T 間期、QTc 間期）與對(duì)照組比較，均無(wú)明顯差異；低劑量組在給藥后 60、90、120 min 與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較 P-R 間期均延長(zhǎng)，與藥前比較無(wú)明顯差異；其他時(shí)間點(diǎn)未見異常；各組動(dòng)物心電圖波形均未見異常改變。血壓指標(biāo)：給藥后各劑量組動(dòng)物的收縮壓與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，低劑量組在藥后 60 min與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，平均動(dòng)脈壓和舒張壓均降低，與藥前比較無(wú)明顯差異，其他時(shí)間點(diǎn)未見異常。呼吸系統(tǒng)指標(biāo)：各給藥組動(dòng)物的呼吸頻率、呼吸幅度與對(duì)照組比較未見明顯差異。因此，可以確認(rèn)各組藥物對(duì)狗呼吸系統(tǒng)無(wú)明顯影響。

圖2 rHSA/GCSF 對(duì)60Coγ 射線照射小鼠 WBC 水平的影響Figure 2 The effect of rHSA/GCSF on peripheral WBC of mice after irradiated with60Coγ rays

圖3 rHSA/GCSF 對(duì)60Coγ 照射猴 WBC 數(shù)變化的影響Figure 3 The effect of rHSA/GCSF on peripheral WBC of monkey after irradiated with60Coγ rays

2.3 安全性評(píng)價(jià)

2.3.1急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn) 給藥后就一般生理指標(biāo)連續(xù)觀察 4 h，所有動(dòng)物未見異常反應(yīng)；試驗(yàn)期間，動(dòng)物精神狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，呼吸平穩(wěn)，被毛光滑，大便成型色正，未見異常表現(xiàn)。給藥后7 d 和 13 d 分別測(cè)定了每籠中的剩余飼料，并計(jì)算每只動(dòng)物平均每天的食量。結(jié)果顯示給藥組雌性和雄性動(dòng)物的食量與同期對(duì)照組比較未見明顯影響。皮下給藥組雌雄性動(dòng)物各給藥組的平均體重在給藥后 3、7、10 和 14 d 與同期對(duì)照組比較，均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。靜脈注射給藥組雄性動(dòng)物的平均體重在給藥后 3、7 和 10 d 與同期對(duì)照組比較體重降低（P＜ 0.05），體重增長(zhǎng)減緩；而雌性動(dòng)物體重在藥后 3、7和 10 d 與同期對(duì)照組比較，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述情況可能與給藥有關(guān)或與動(dòng)物性別有關(guān)。觀察期結(jié)束后對(duì)動(dòng)物施行安樂死并進(jìn)行大體解剖，均未見異常。試驗(yàn)確認(rèn)重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白單次皮下和靜脈注射給予小鼠的最大耐受量（MTD）≥ 37.5 mg/kg。試驗(yàn)中未見影響研究可靠性和造成研究工作偏離實(shí)驗(yàn)方案的其他異常情況。

2.3.1.2食蟹猴急性毒性實(shí)驗(yàn) 3 個(gè)給藥劑量組的動(dòng)物一般臨床考察、體溫、體重、食量、心電圖均未見顯著異常。3 個(gè)給藥組給藥后 WBC 明顯升高，2.3 mg/kg 組和 5.2 mg/kg 組給藥后 4 d 達(dá)最高值，11.6 mg/kg 組藥后 5 d 達(dá)最高值，之后逐漸回落，至給藥后 14 d 未恢復(fù)給藥前水平；同時(shí)中性粒細(xì)胞數(shù)明顯升高，淋巴細(xì)胞數(shù)也有小幅升高，2.3 mg/kg 和 5.2 mg/kg 組藥后第 4 天，11.6 mg/kg組藥后第 3 天達(dá)最高值。RBC、HGB 和 HCT 給藥后 2 ～ 7 d 略有降低，藥后 14 d 下降較明顯。Ret 藥后小幅升高至藥后 4 d 逐漸回落，藥后 14 d出現(xiàn)明顯升高。PLT 藥后 2 ～ 7 d 內(nèi)逐漸降低，而藥后 14 d 則明顯升高。血生化指標(biāo)顯示給藥劑量為 2.3 mg/kg，藥后 7 d 和 14 d A/G 略有下降，血清 Alb 略有下降而 TP 略有增加；給藥后 14 d TBil 略有升高。ALP 給藥后 3 d 和 7 d 升高，給藥后 14 d 基本恢復(fù)。GLU 給藥后 7 d 略有升高。給藥劑量為 5.2 mg/kg，給藥后 1 d ALT 和 AST明顯升高，給藥后 3 d 略有恢復(fù)但仍高于藥前值，給藥后 7 d 基本恢復(fù)藥前水平；A/G 給藥后 7 d 和 14 d 略有下降，血清 Alb 略有下降而 TP 變化不大；TBil 給藥后 3 d 升高。CK 給藥后 1 d 升高，ALP 給藥后 3 d 和 7 d 升高，給藥后 14 d基本恢復(fù)。GLU 給藥后 14 d 升高。給藥劑量為11.6 mg/kg，給藥后 3 d AST 升高，給藥后 7 d 和14 d A/G 略有下降；TBil 給藥后 7 d 略有增加。CK 給藥后 3 d 升高，ALP 給藥后 1、3 和 7 d 逐漸升高，給藥后 7 d 達(dá) 3349 U/L，給藥后 14 d 下降，但仍高于給藥前值。尿液檢查各組未見異常。3 個(gè)劑量組動(dòng)物安樂死后，取胸骨骨髓涂片，鏡下觀察可見骨髓增生極度活躍。2.3 mg/kg 給藥組的動(dòng)物 MIE 為 1.59∶1，粒系增生活躍，占 47.0％，各階段細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常；紅系增生活躍，占29.5％，早期細(xì)胞少見，成熟紅細(xì)胞大小、形態(tài)未見明顯異常。淋巴細(xì)胞占 22.0％，細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常；巨核細(xì)胞易見，血小板易見。5.2 mg/kg給藥組的動(dòng)物 MIE 為 1.05∶1，粒系增生活躍，占46.0％，各階段細(xì)胞比值、形態(tài)未見明顯異常；紅系增生明顯活躍，占 43.5％，晚紅細(xì)胞比值增多，占 30.0％，細(xì)胞基本形態(tài)正常，成熟紅細(xì)胞大小、形態(tài)大致正常。淋巴細(xì)胞占 10.0％，細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常；巨核細(xì)胞易見，血小板易見。11.6 mg/kg給藥組的動(dòng)物 MIE 為 1.71∶1，粒系增生活躍，占55.0％，桿狀核粒細(xì)胞比值偏高，占 30.0％，部分中、晚幼粒細(xì)胞可見漿中顆粒增多現(xiàn)象；紅系增生活躍，占 32.0％，部分晚紅細(xì)胞可見核畸變，成熟紅細(xì)胞大小、形態(tài)未見明顯異常。淋巴細(xì)胞占10.5％，細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常；巨核細(xì)胞易見，血小板易見。各劑量組的食蟹猴病理解剖未見由于給藥產(chǎn)生的異常。在本試驗(yàn)條件下，rHSA/GCSF單次皮下注射給予食蟹猴的最大耐受劑量為11.6 mg/kg。

2.3.2長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)

2.3.2.1大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn) 臨床觀察：試驗(yàn)期間無(wú)動(dòng)物死亡。主要臨床表現(xiàn)為第 7 ～ 16 次給藥后給藥組共有 7 只動(dòng)物出現(xiàn)后肢腫脹，其中，高劑量組 3 只動(dòng)物（均為雄性），最早出現(xiàn)在給藥6 周左右，中劑量組 4 只動(dòng)物（雄 3 只，雌1 只），最早出現(xiàn)在給藥 3 ～ 4 周時(shí)，低劑量組未見類似癥狀出現(xiàn)。各給藥組動(dòng)物食量、體溫、體重、體重增長(zhǎng)量和體重增長(zhǎng)率與同期對(duì)照組相比未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

血液學(xué)指標(biāo)：血細(xì)胞計(jì)數(shù)，包括總白細(xì)胞計(jì)數(shù)、粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞系、凝血功能、血液生化指標(biāo)、尿液等，結(jié)果表明總白細(xì)胞計(jì)數(shù)、粒細(xì)胞計(jì)數(shù)有顯著升高（圖 4）。

抗體測(cè)定：給藥 2 周時(shí)，各劑量組雌性動(dòng)物均產(chǎn)生抗 GCSF 的抗體（每組均為 5/5），各劑量組雄性動(dòng)物中部分動(dòng)物產(chǎn)生了抗 GCSF 的抗體（每組均為 4/5）。給藥 4 周時(shí)，各劑量組雌性動(dòng)物均檢測(cè)到抗 GCSF 的抗體（每組均為 5/5）；高劑量組雄性動(dòng)物均檢測(cè)到抗GCSF的抗體，中、低劑量組雄性動(dòng)物部分檢測(cè)到了抗 GCSF 的抗體（低劑量 3/5，中劑量2/5，高劑量 5/5）。高劑量組動(dòng)物抗體滴度有增強(qiáng)趨勢(shì)，中、低劑量組抗體滴度未見明顯增強(qiáng)。給藥 8 周，各劑量組動(dòng)物均檢測(cè)到了抗 GCSF 的抗體（每組均為 10/10，雌雄各半）。末次給藥后，抗體滴度未見明顯增強(qiáng)，抗體滴度維持給藥 8 周時(shí)水平或略有波動(dòng)?；謴?fù)期結(jié)束時(shí)，各劑量組雌性動(dòng)物抗體滴度明顯減弱，雄性動(dòng)物抗體滴度略有減弱。中和抗體結(jié)果顯示，產(chǎn)生的抗體為中和抗體，可部分中和藥物活性。

圖4 rHSA/GCSF 反復(fù)皮下注射給大鼠 13 周對(duì)雄性（A）、雌性（B）大鼠外周血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響Figure 4 The effect of rHSA/GCSF on peripheral neutrophil counts of rats after 13 weeks’ repeated subcutaneous injections

骨髓涂片：給藥 4 周安樂死的動(dòng)物骨髓涂片結(jié)果顯示，各給藥組骨髓細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常，部分動(dòng)物中晚粒細(xì)胞可見胞漿顆粒增多現(xiàn)象；在數(shù)值上，僅 1200 μg/kg 組雄性動(dòng)物粒細(xì)胞系比例與同期對(duì)照組比增加（P＜ 0.05），其他給藥組雌雄動(dòng)物粒細(xì)胞系比例與同期對(duì)照組比較雖未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均有增加趨勢(shì)，其中以中性粒細(xì)胞增加為主，中性粒細(xì)胞中各階段細(xì)胞均有增加趨勢(shì)。各劑量組雄性動(dòng)物紅細(xì)胞系比例有下降趨勢(shì)，雌性動(dòng)物未見紅細(xì)胞系比例有下降，但雌雄動(dòng)物粒紅比值均有增加。各劑量組雌雄動(dòng)物淋巴細(xì)胞比例均有下降趨勢(shì)。其他系統(tǒng)未見明顯異常。末次給藥后安樂死的動(dòng)物骨髓涂片結(jié)果顯示，各給藥組骨髓細(xì)胞形態(tài)未見明顯與異常，部分動(dòng)物中晚粒細(xì)胞可見胞漿顆粒增多現(xiàn)象；在數(shù)值上，與同期對(duì)照組比較，僅1200 μg/kg 組雄性動(dòng)物粒紅比值下降（P ＜ 0.01），其他給藥組雌雄動(dòng)物各系比例均未見明顯異常。另有 5000 μg/kg 組個(gè)別雄性動(dòng)物粒系比例和粒紅比值明顯升高，紅細(xì)胞系增生減低?；謴?fù)期結(jié)束安樂死的動(dòng)物骨髓涂片結(jié)果顯示，各給藥組骨髓細(xì)胞形態(tài)未見明顯與異常，部分動(dòng)物中晚粒細(xì)胞可見胞漿顆粒增多現(xiàn)象；在數(shù)值上，與同期對(duì)照組比較，各給藥組雌雄動(dòng)物各系細(xì)胞比例均未見明顯異常。

臟器重量和臟器系數(shù)：給藥 4 周時(shí)，與同期對(duì)照組相比較，雌性動(dòng)物各劑量組未見明顯異常；雄性動(dòng)物 5000 μg/kg 組腎臟和睪丸重量增加（P ＜0.05），但臟器系數(shù)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。1200 μg/kg 組及 5000 μg/kg 組雌雄動(dòng)物脾臟重量、臟體比和臟腦比與同期對(duì)照組比較雖未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但數(shù)值上有增加趨勢(shì)。

末次給藥后，與同期對(duì)照組相比較，雌性動(dòng)物各劑量組未見明顯異常；雄性動(dòng)物 5000 μg/kg 組脾臟重量、臟體比和臟腦比增加（P ＜ 0.01）。恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，與同期對(duì)照組相比較，雌性動(dòng)物各劑量組未見明顯異常；5000 μg/kg 組雄性動(dòng)物脾臟重量、臟體比和臟腦比增加（P ＜ 0.01），1200 μg/kg 組脾臟重量和臟腦比增加（P ＜ 0.05）。

組織病理學(xué)檢查：生理鹽水對(duì)照組在給藥4 周、末次給藥后 2 d 及停藥 4 周后安樂死的動(dòng)物中，少數(shù)可見肝臟、心臟、肺臟、腎臟等組織器官的大鼠常見自發(fā)病或背景性病理改變。頸背部給藥局部皮下組織均未見明顯異常改變。少數(shù)動(dòng)物可見與對(duì)照組相似的病理改變，部分動(dòng)物可見不同程度的脾臟和肝臟髓外造血，主要表現(xiàn)為脾臟紅髓及小梁周圍可見粒系造血細(xì)胞集落及成熟中性粒細(xì)胞，以晚幼粒細(xì)胞及桿狀核細(xì)胞為主；肝臟小葉內(nèi)或匯管區(qū)周圍可見造血細(xì)胞集落，以晚幼粒細(xì)胞及桿狀核細(xì)胞為主；肺臟肺泡壁內(nèi)成熟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；骨髓粒系造血細(xì)胞增多，并可見成熟中性粒細(xì)胞。給藥組個(gè)別動(dòng)物可見皮下組織水腫和跟骨、跖骨膜內(nèi)成骨改變。給藥局部可見不同程度的皮下灶狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)。上述表現(xiàn)停藥后均可恢復(fù)。

開展長(zhǎng)毒試驗(yàn)中無(wú)其他影響研究可靠性和造成研究工作偏離實(shí)驗(yàn)方案的異常情況。

2.3.2.2食蟹猴長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn) 各劑量組臨床一般觀察、體重、食量、體溫、心電圖沒有發(fā)現(xiàn)顯著異常。血液學(xué)指標(biāo)檢查顯示白細(xì)胞升高并與劑量有直接關(guān)系（圖 5）。試驗(yàn)期間，各組動(dòng)物在觀察時(shí)未見明顯的與給藥相關(guān)的異常改變。給藥動(dòng)物體重、體溫、攝食量及心電圖指標(biāo)未見明顯異常。給予 rHSA/GCSF 后，各給藥組可見白細(xì)胞和紅系血細(xì)胞數(shù)的改變，表現(xiàn)為給藥后外周血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞升高，末次給藥后白細(xì)胞有降低趨勢(shì)；HGB、RBC、HCT 降低，PLT 未見明顯異常。停藥觀察4 周，各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)的改變可恢復(fù)。血凝指標(biāo)PT、APTT 均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，未見具有毒理意義的規(guī)律性改變。各組動(dòng)物生化指標(biāo)、尿常規(guī)指標(biāo)和眼科檢查未見異常。

給藥后動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體的檢測(cè)顯示給藥2 周，30、150、750 μg/kg 組均有部分動(dòng)物（分別為 2/6、2/6、4/6）產(chǎn)生了抗 GCSF 抗體，抗體滴度最高達(dá)1∶1600。給藥 4 周，750 μg/kg 組所有動(dòng)物（6/6）均產(chǎn)生了抗 GCSF 抗體，30、150 μg/kg組仍有部分動(dòng)物產(chǎn)生了抗體（分別為 2/6、4/6）。給藥 6 周和 8 周，150、750 μg/kg組所有動(dòng)物（6/6）均產(chǎn)生了抗 GCSF 抗體，30 μg/kg 組有4/6 只動(dòng)物產(chǎn)生了抗體，抗體滴度最高達(dá) 1∶6400。停藥后，抗體滴度均有顯著下降趨勢(shì)。給藥期間監(jiān)測(cè)的抗體情況顯示動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生了抗 GCSF 抗體，該抗體具有中和 rHSA/GCSF 活性的作用。

猴骨髓細(xì)胞學(xué)檢查未見明顯異常。病理改變主要為 150 μg/kg 和 750 μg/kg 組部分動(dòng)物骨髓幼稚粒細(xì)胞增多和髓外造血。末次給藥后及恢復(fù)期結(jié)束安樂死的所有動(dòng)物尸檢均未見明顯與給藥相關(guān)的異常改變。與同期對(duì)照組比較，末次給藥后及恢復(fù)期結(jié)束各組動(dòng)物的臟器重量及臟器系數(shù)未見具有毒理意義的變化。組織學(xué)檢查未見顯著與給藥相關(guān)的組織器官和給藥局部異常。

在本試驗(yàn)條件下，rHSA/GCSF 反復(fù)皮下注射給予食蟹猴，劑量為 30、150、750 μg/kg，每周給藥 1 次，連續(xù)給藥 8 周，可引起動(dòng)物外周血白細(xì)胞升高，主要為中性粒細(xì)胞升高，RBC、HGB、HCT降低，病理組織學(xué)檢查可見中、高劑量組部分動(dòng)物骨髓幼稚粒細(xì)胞增多和髓外造血。停藥后可恢復(fù)。30 μg/kg 組動(dòng)物主要反應(yīng)為白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞升高，紅細(xì)胞和血紅蛋白輕度降低，未見其他毒性反應(yīng)。所以 rHSA/GCSF 反復(fù)給予食蟹猴的安全劑量為 150 μg/kg。

rHSA/GCSF 反復(fù)給予食蟹猴，動(dòng)物體內(nèi)可產(chǎn)生抗體，抗體具有中和活性的作用，反復(fù)給藥后可使血藥濃度下降。rHSA/GCSF 反復(fù)給予食蟹猴可產(chǎn)生局部輕度刺激反應(yīng)，停藥后可恢復(fù)。

圖5 rHSA/GCSF 反復(fù)皮下注射給予食蟹猴 8 周對(duì)外周血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響Figure 5 The effect of rHSA/GCSF on peripheral neutrophil counts of monkeys after 8 weeks’ repeated subcutaneous injections

2.4 藥代/毒代評(píng)價(jià)

2.4.1藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)125I-rHSA/GCSF 的放化純度結(jié)果顯示達(dá)（95.43 ± 1.09）％。取配制后的125I-rHSA/ GCSF（60 μg/ml）2.0 μl，經(jīng) γ-Counter 測(cè)定其 cpm 值為 117303，經(jīng)求算其平均比活度為23.27 Bq/ng。rHSA/GCSF 原液活性為：2.60E + 06 IU/ml，比活性為：1.88E + 07 IU/mg；125I-rHSA/ GCSF 活性為：1.67E + 06 IU/ml，比活性為：1.52E + 07 IU/mg。計(jì)算得出標(biāo)記后蛋白比活性下降約為19.2％（為標(biāo)記前的 81.8％），能夠滿足測(cè)定要求。檢測(cè)方法的原理及特異性：經(jīng) 10％ TCA 酸沉淀后，125I-HSA/GCSF 原形主要在酸沉淀部分。方法靈敏度取決于125I-rHSA/GCSF 的比活度和放射性測(cè)量時(shí)間，對(duì)低放射性樣品測(cè)量時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)的靈敏度定為每克組織或者每毫升體液比本底放射性計(jì)數(shù)高 1 Bq，約為 2 Bq/g（或Bq/ml）組織濕重或體液，相當(dāng)于 0.09 ng-當(dāng)量/g（ml）組織濕重（體液）。實(shí)際測(cè)量精密度 ＜ 20％ 的 LOQ 約為 0.12 ng-當(dāng)量/g（ml）。在 0.12 ～ 1200 ng-當(dāng)量范圍內(nèi)，不同組織/體液中加入125I-HSA/GCSF，加入量與總放射性以及 TCA 沉淀放射性之間的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于 0.99，CV％ 多數(shù)小于20％。不同組織/體液中加入125I-rHSA/GCSF 溶液，大部分組織/體液 TCA 可沉淀部分的放射性占總放射性的 90％ 以上，提示在實(shí)驗(yàn)條件下125I-rHSA/ GCSF 原形主要在 TCA 沉淀部分。酸沉淀方法學(xué)確證表明，本方法基本滿足分布試驗(yàn)要求。

組織分布：小鼠皮下注射125I-rHSA/GCSF 后，多數(shù)組織/多數(shù)時(shí)間點(diǎn) TCA 沉淀放射性/總放射性的比值都較高，表明125I-rHSA/GCSF 大部分集中在TCA 沉淀中。尿的 TCA 沉淀放射性比例很小，說(shuō)明尿液中為可溶性的小分子代謝物。125I-rHSA/GCSF在小鼠的不同組織/器官的分布見圖 6。該藥物主要經(jīng)腎臟排泄，并且藥物不易透過(guò)血-腦脊液屏障。方法學(xué)證明125I-rHSA/GCSF 大部分存在 TCA 沉淀部分，故沉淀部分放射性比總放射性更接近于原形藥物的分布情況。

血清125I-rHSA/GCSF 放射性濃度：大鼠皮下注射、靜脈注射125I-rHSA/GCSF 后，不同時(shí)間血清總放射性及 TCA 沉淀放射性見表 2。125I-rHSA/ GCSF 在食蟹猴體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)125I-rHSA/ GCSF 總放射性和 TCA 沉淀放射性的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表 3。

靜脈注射125I-rHSA/GCSF 后總放射性和TCA 沉淀放射性的末端t1/2分別為（32.38 ± 3.83）和（31.96 ± 3.80）h；Cmax分別為（7551.33 ± 2964.69）和（7517.14 ± 2940.13）ng-當(dāng)量/ml，AUC(0-t)分別為（48.43 ± 15.93）和（45.57 ± 14.89）h*μg-當(dāng)量/ml；AUCinf分別為（49.21 ± 16.06）和（46.30 ± 15.01）h*μg-當(dāng)量/ml；Vd分別為（63.99 ± 27.66）和（67.39 ± 9.85）ml；Cl 分別為（1.35 ± 0.50）和（1.44 ± 0.56）ml/h；MRT 分別為（22.20 ± 3.75）和（22.66 ± 3.54）h。

尿、糞中放射性的排泄：大鼠皮下注射125I-rHSA/GCSF 后 9 d 內(nèi)糞和尿放射性的排泄顯示放射性主要經(jīng)尿排泄，少量經(jīng)糞排泄，9 d 后尿、糞分別排出注入放射性量的（84.63 ± 17.32）％和（3.76 ± 1.41）％，尿、糞合計(jì)排出注入放射性量的（88.40 ± 18.43）％。

圖6 小鼠皮下注射125I-HSA/GCSF 后組織分布圖Figure 6 The tissues distribution of mice after subcutaneous injection of125I-HSA/GCSF

表2 125I-rHSA/GCSF 在大鼠體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Table 2 Metabolism kinetic parameters comparison of rats after subcutaneous/intravenous injection of125I-HSA/GCSF

膽汁放射性的排泄：大鼠皮下注射125I-rHSA/GCSF 后 8 h 內(nèi)膽汁排泄放射性為（1.30 ± 0.48）％。

體外血漿蛋白結(jié)合：未發(fā)現(xiàn)125I-rHSA/GCSF與血漿蛋白結(jié)合。

部分血清、膽汁、尿液樣品的 SEC-HPLC 分析：結(jié)果顯示了膽汁及尿樣中為小分子的125I-rHSA/GCSF 降解產(chǎn)物，無(wú)原形存在；血清中125I-rHSA/GCSF 的原形峰和降解產(chǎn)物峰并存，并且不同時(shí)間點(diǎn)，125I-rHSA/GCSF 原型峰強(qiáng)度隨時(shí)間而變化。

2.4.2食蟹猴的藥代/毒代動(dòng)力學(xué) 首次 s.c. 注射不同劑量的 rHSA/GCSF，在食蟹猴體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表 3。在毒代動(dòng)力學(xué)分析中，rHSA/GCSF 在 3 個(gè)劑量水平（30、150 及 750 μg/kg）多次給予食蟹猴，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿藥物濃度及代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)（除高劑量組 MRT 外）在性別間均未見統(tǒng)計(jì)差異，Cmax、AUC隨著劑量增加而升高，基本呈現(xiàn)線性動(dòng)力學(xué)特征（表 4）。第 8 次給藥后，大多數(shù)樣品中 rHSA/GCSF 含量低于檢測(cè)限。rHSA/GCSF連續(xù)給藥后，在食蟹猴體內(nèi)未見蓄積。

表3 皮下注射 rHSA/GCSF 后食蟹猴藥代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)（x±s，n = 4）Table 3 Pharmacokinetics parameters of monkeys after subcutaneous administration of rHSA/GCSF

表4 rHSA/GCSF 給予食蟹猴后毒代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 The toxicokinetics of monkeys after subcutaneous administration of rHSA/GCSF

3 討論

藥效學(xué)試驗(yàn)表明 rHSA/GCSF 可以使骨髓粒系增生活躍，骨髓粒系造血細(xì)胞及成熟中性粒細(xì)胞均明顯增多，對(duì)白細(xì)胞低下，尤其是粒白細(xì)胞低下癥有治療作用。毒性試驗(yàn)考察了 rHSA/GCSF 對(duì)食蟹猴骨髓造血的影響。rHSA/GCSF 在 30 ～ 750 μg/kg 劑量下，皮下注射給予食蟹猴，可促使動(dòng)物骨髓粒系造血活躍，主要表現(xiàn)為外周血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞明顯增多，骨髓病理組織學(xué)觀察中也可見 150 μg/kg 和 750 μg/kg 劑量組的部分動(dòng)物骨髓粒系增生活躍，幼稚粒細(xì)胞增多。髓外造血也是考察的內(nèi)容，在本試驗(yàn)中，在 750 μg/kg 劑量組的 1 只動(dòng)物可見脾竇中性粒細(xì)胞數(shù)量增多現(xiàn)象，而在其他劑量下未見明顯的髓外造血，在 rHSA/GCSF 的大鼠反復(fù)給藥的毒性試驗(yàn)中，可見較明顯的肝脾的髓外造血。需要討論的是關(guān)于祖細(xì)胞耗竭的問題，重組人粒細(xì)胞集落刺激因子可促進(jìn)骨髓中性粒細(xì)胞生成，并促使其成熟并釋放至外周血中，在反復(fù)給藥的毒性試驗(yàn)中，持續(xù)刺激骨髓向粒系祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同時(shí)關(guān)注能否導(dǎo)致骨髓祖細(xì)胞的耗竭。在本試驗(yàn)中，從骨髓涂片檢查及骨髓病理組織學(xué)檢查中均未發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞系及其他細(xì)胞系的明顯抑制。動(dòng)物試驗(yàn)證明對(duì)食蟹猴外周血細(xì)胞數(shù)的影響，rHSA/GCSF 在30 ～ 750 μg/kg 劑量下給予食蟹猴，可明顯提高動(dòng)物外周血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞數(shù)，同時(shí)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞也有不同程度的增加。出現(xiàn)外周血紅細(xì)胞、血紅蛋白和紅細(xì)胞容積下降，有劑量關(guān)系，但下降幅度較?。ā?同期對(duì)照組的 15％）。上述貧血現(xiàn)象在普通 GCSF 產(chǎn)品中也有發(fā)生，文獻(xiàn)[5]報(bào)道可能是由于骨髓粒細(xì)胞加速增殖導(dǎo)致紅細(xì)胞系造血受到輕度的抑制，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。rHSA/GCSF 對(duì)外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響在停藥后可恢復(fù)，是可逆性反應(yīng)。食蟹猴毒性試驗(yàn)中部分動(dòng)物外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量下降，血小板計(jì)數(shù)給藥后出現(xiàn)降低，藥后 14 d 出現(xiàn)異常增高。文獻(xiàn)中報(bào)道粒細(xì)胞集落刺激因子用于臨床，對(duì)正常受試者外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響也有上述類似反應(yīng)[6]。給藥后，動(dòng)物血清堿性磷酸酶顯著增高，其中 2.3 mg/kg 和 5.2 mg/kg 組動(dòng)物給藥后 3 d 達(dá)最高值，11.6 mg/kg 組動(dòng)物給藥后 7 d 達(dá)最高值，并且堿性磷酸酶升高與給藥劑量有關(guān)。ALP 在成熟中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿中可以檢測(cè)到，有文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道應(yīng)用普通的 GCSF 可以刺激中性粒細(xì)胞中 ALP 的合成，并且 ALP 很可能是通過(guò)損傷或死亡的中性粒細(xì)胞釋放到血流中去的。Kato 等[9]在普通 GCS 給予大鼠的試驗(yàn)中也認(rèn)為血清中 ALP 增高源于中性粒細(xì)胞。

融合蛋白的安全性主要考察的內(nèi)容是 rHSA/ GCSF 作為藥物使用是否會(huì)產(chǎn)生抗原性的問題。試驗(yàn)觀察到給藥 2 周、4 周，3 個(gè)劑量組均有部分動(dòng)物產(chǎn)生了抗 GCSF 抗體，給藥 6 周以后，150 μg/kg 和 750 μg/kg 劑量組所有動(dòng)物均產(chǎn)生了抗 GCSF 抗體，30 μg/kg 劑量組仍只有 4/6 只動(dòng)物產(chǎn)生了抗 GCSF 抗體，停藥后，抗體滴度有下降趨勢(shì)?？?GCSF 抗體可見部分中和 GCSF 活性的作用?？贵w產(chǎn)生后，再次給予 rHSA/GCSF，動(dòng)物生物反應(yīng)下降?？紤]到血清白蛋白具有極為強(qiáng)烈的種屬差異，受試動(dòng)物注射給予異源白蛋白將產(chǎn)生結(jié)合抗體，這也使得 rHSA/GCSF 融合蛋白高劑量時(shí)在大鼠、食蟹猴反復(fù)給藥中很快出現(xiàn)結(jié)合抗體，抗體具有中和抗體的表現(xiàn)是可以預(yù)期的。但是在人體中同源的人血清白蛋白，應(yīng)該較不易產(chǎn)生結(jié)合抗體。在動(dòng)物體內(nèi)觀察到的現(xiàn)象是否與在人體中相同，這也是需要開展臨床試驗(yàn)的理由。另外，融合蛋白與抗體結(jié)合是否會(huì)同時(shí)影響融合蛋白中的細(xì)胞因子（例如：GCSF、EPO）與相應(yīng)受體的結(jié)合？融合蛋白與抗體結(jié)合的復(fù)合體是如何在血液中清除？在清除過(guò)程中細(xì)胞因子獲得釋放仍然具有與其受體結(jié)合的能力和功能也是需要開展臨床試驗(yàn)的理由。

本研究選擇的依據(jù)是 rHSA/GCSF 是重組融合蛋白，其分子結(jié)構(gòu)包含 HSA 和 GCSF 兩個(gè)部分，這個(gè)設(shè)計(jì)是希望達(dá)到如下目的：

首先，保持 GCSF 的生物學(xué)活性，升高白細(xì)胞，治療放療和化療引起的白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞）減少癥；其次，作用長(zhǎng)效，常規(guī) rhG-CSF 需要每天給藥 1 次，以維持白細(xì)胞水平，希望 rHSA/ GCSF 的半衰期延長(zhǎng)，給藥 1 次，維持 3 ～ 7 d 的升白作用，但不希望過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)將會(huì)使得升白作用難以控制，而出現(xiàn)安全隱患；最后，在發(fā)揮長(zhǎng)效治療作用的同時(shí)，不帶來(lái)新的安全隱患，就是說(shuō)不出現(xiàn)常規(guī) rhG-CSF 以外的毒性反應(yīng)。

為評(píng)價(jià) rHSA/GCSF 是否達(dá)到上述研制目標(biāo)，我們開展了藥理毒理動(dòng)物試驗(yàn)研究，試驗(yàn)選擇的考慮如下：

⑴升白作用和特點(diǎn)

CFU-GM 形成試驗(yàn)：該試驗(yàn)是考察 rHSA/ GCSF 是否和 rhG-CSF 一樣，具有與 GCSF 受體結(jié)合而刺激粒系祖細(xì)胞增殖的作用，反應(yīng)分子設(shè)計(jì)的合理性。試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了 rHSA/GCSF 可以與GCSF 受體結(jié)合，但其刺激集落形成的能力低于rhG-CSF，表明與 HSA 結(jié)合在體外降低 GCSF 活性，這與其他修飾蛋白的長(zhǎng)效制劑（如 PEG-rhGCSF）一致。

小鼠和猴白細(xì)胞減少癥試驗(yàn)：為觀察 rHSA/ GCSF 在不同種動(dòng)物的反應(yīng)，我們開展了嚙齒類和非人靈長(zhǎng)類（NHP）試驗(yàn)，結(jié)果顯示在兩種動(dòng)物上，都發(fā)揮出治療作用，但在 NHP 作用更突出，有效劑量更低，更敏感；這說(shuō)明開展 NHP 試驗(yàn)的價(jià)值。

化療模型和放療模型：為了解 rHSA/GCSF 對(duì)化療和放療引起的白細(xì)胞減少癥的治療作用，我們分別開展了兩種模型的研究。由于放療模型，可以獲得長(zhǎng)時(shí)間的白細(xì)胞減少癥模型，便于觀察療效和發(fā)現(xiàn)治療特點(diǎn)，這也是考慮放療模型的原因之一。

⑵長(zhǎng)效作用

認(rèn)識(shí)其代謝特點(diǎn)、以及分子代謝與生物學(xué)作用之間的關(guān)系，對(duì)臨床試驗(yàn)的方案制定具有重要意義。為此按照生物制品研究的常規(guī)要求，開展了小鼠和大鼠的藥代動(dòng)力學(xué)、組織分布、排泄消除和體外血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)，測(cè)定了食蟹猴體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和生物利用度，并觀察了藥效動(dòng)力學(xué)。

⑶安全性評(píng)價(jià)

按照法規(guī)要求和 rHSA/GCSF 的動(dòng)物敏感性特點(diǎn)開展了系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，獲得了安全劑量、毒性反應(yīng)特點(diǎn)、毒性靶器官。

對(duì)研究結(jié)果的分析和評(píng)價(jià)獲得如下幾點(diǎn)。

⑴有效性分析

升白作用：試驗(yàn)結(jié)果顯示，rHSA/GCSF 在小鼠模型和猴模型都顯示出顯著的升白（升粒細(xì)胞）作用，且表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，在猴試驗(yàn)中量效關(guān)系良好，表明 rHSA/GCSF 具有 rhG-CSF 相似的生物學(xué)作用，在給藥后次日白細(xì)胞出現(xiàn)明顯升高，起效快。

有效劑量：在小鼠試驗(yàn)中 150 μg/kg、在猴試驗(yàn)中 15 μg/kg 顯示出顯著的升白作用，達(dá)到和超過(guò) rhG-CSF 的治療作用，也表明猴更敏感。

長(zhǎng)效特征：小鼠和猴的藥效試驗(yàn)都顯示出相似的長(zhǎng)效作用，給藥 1 次，可維持白細(xì)胞水平高于模型組（最低點(diǎn)與陽(yáng)性對(duì)照組相似）4 d；藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，大鼠皮下注射的 t1/2為（43.97 ± 6.36）h；單次皮下注射給予食蟹猴 rHSA/GCSF 的t1/2分別為（42.75 ± 16.82）h（5 μg/kg）、（37.13 ± 4.81）h（15 μg/kg）和（36.03 ± 6.87）h（50 μg/kg）；在嚙齒類和 NHP 相似。這一結(jié)果也與 Halpern 等[3]報(bào)道在 Cynomolgus 猴中給藥劑量為 100 ～1000 μg/kg 時(shí)的 t1/2、MRT 和 CL/F（清除率/蓄積因子）分別是 7.73 ～ 13.3 h、19.4 ～ 27.3 h 和 7.90 ～27.5 ml/h/kg 趨勢(shì)相似，但 t1/2要長(zhǎng)約 3 倍。

劑量與作用時(shí)間：小鼠和猴的藥效試驗(yàn)都顯示，較高的劑量可以使白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加幅度大，但并不延長(zhǎng)其升白作用時(shí)間；這與不同劑量的 t1/2相似，甚至高劑量的 t1/2更短有關(guān)。劑量增加，但生物作用時(shí)間不延長(zhǎng)，可能與白細(xì)胞介導(dǎo)的 GCSF消除有關(guān)。

⑵安全性分析

rHSA/GCSF 的總體安全性好，在劑量高達(dá)11.6 mg/kg 時(shí)，猴沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性反應(yīng)。大鼠和猴反復(fù)給藥的毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，其安全劑量分別為 300 和 150 μg/kg，分別是猴有效劑量（15 μg/kg）的 20 和 10 倍。

主要毒性反應(yīng)和毒性靶器官：包括肝功能異常，ALT、AST 和 CK 的一過(guò)性升高、后肢腫脹、骨結(jié)構(gòu)異常、髓外造血、ALP 升高、白血病在組織中的浸潤(rùn)、輕度貧血、脾臟增大，這些變化停藥后可恢復(fù)。其主要毒性靶器官是骨骼和過(guò)度刺激而引起的骨髓抑制。

毒性反應(yīng)的主要指征：毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，臨床試驗(yàn)中應(yīng)注意監(jiān)測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、RBC（HGB、HCT、Ret）、ALT、AST、CK、ALP。

與 rhG-CSF 毒性反應(yīng)的差別：毒理學(xué)研究結(jié)果顯示，rHSA/GCSF 的毒性表現(xiàn)與常規(guī) rhG-CSF產(chǎn)品相似，沒有出現(xiàn)新的不良反應(yīng)。

臨床前研究結(jié)果顯示，rHSA/GCSF 顯示出與rhG-CSF 相似的生物學(xué)作用，可以用于治療放療和化療引起的白細(xì)胞減少癥，以及其他 rhG-CSF 的適應(yīng)證。最敏感動(dòng)物猴的藥效試驗(yàn)顯示，15 μg/kg（約 180 μg/m2）顯示出顯著的療效，該劑量引起的白細(xì)胞升高，高于藥前值。以該劑量為基礎(chǔ)，推算人用起始劑量為 280 μg/人（約為 300 μg/人）。根據(jù)小鼠和猴的藥效試驗(yàn)結(jié)果顯示，4 d 給藥 1 次，可以維持白細(xì)胞計(jì)高于模型組，并與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)。猴反復(fù)給藥的毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，7 d 給藥1 次，在第 4 天有升白作用，但第 7 天完全恢復(fù)正常，因此，rHSA/GCSF 的升白作用持續(xù)時(shí)間在4 ～ 7 d。小鼠和猴的生物反應(yīng)相似，提示在人體的持續(xù)時(shí)間可能相近。

總之，注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白對(duì)白細(xì)胞減少癥有顯著的治療作用，表現(xiàn)出長(zhǎng)效特征，總體安全性好，安全劑量范圍大，為腫瘤患者化療過(guò)程中粒細(xì)胞減少的防治提供了新的選擇。

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Studies on pharmacodynamics, p harmacology, and toxicology of r ecombinant human serum albumin/granulocyte colony-stimulating factor fusion protein

FU Yan*, YIN Li-li*, GU Jing-liang, MA Xian-mei, ZUO Cong-lin, YU Zai-lin

ObjectiveTo examine the pharmacodynamics, pharmacology and toxicology of recombinant serum human albumin/granulocyte colony-stimulating factor fusion protein (rHSA/GCSF), and to obtain the pharmacokinetics and toxicokinetics data for directing the ongoing human clinical trials.MethodsThe rhesus monkey bone marrow cells were used for in vitro pharmacodynamics studies and the colony form unit-granulocyte macrophage (CFU-GM) numbers were counted to evaluate the influence of rHSA/GCSF. The therapeutic efficacy of rHSA/GCSF on leucopenia in mice and monkeys caused by radiation or injection of fluorouracil were evaluated. For pharmacologic study. The influence of rHSA/GCSF on central nervous system of mice and respiratory and cardiovascular systems of dogs were observed. Through acute and chronic toxicity studies, safety evaluation about rHSA/GCSF was performed in mice, rats and cynomolgus monkeys. The pharmacokinetics /toxicokinetics studies were performed to examine the PK parameters and the tissue distributions in above indicated animals.ResultsrHSA/GCSF stimulated the proliferation in granulocytic series of bone marrow and increased the neutrophile granulocytes. rHSA/GCSF had obvious effects on leucopenia in mice caused by fluorouracil. In the early stage of chemotherapy, it slowed down the reduction of white blood cells (WBC), and brought the peripheral neutrophils back the normal level. rHSA/GCSF reduced the duration of absolute neutrophil count (ANC) nadir in leucopenia model caused by radiation in mice and accelerated the recovery of the peripheral WBC. Meanwhile, it had less influence on red blood cell (RBC) and platelet (PLT). Results in mice and monkeys showed that rHSA/GCSF had long-lasting effect. PD/PK data showed that the half-life of rHSA/GCSF was approximately 38.6 hours; single dose of rHSA/GCSF (500, 1500 and 3000 μg/kg) had no effect on nervous system of mice and no synergistic effect with pentobarbital sodium. Furthermore, single dose of rHSA/GCSF (50 and 200 μg/kg) had no effect on respiratory and cardiovascular systems of dogs. In single-dose toxicity studies, the maximum tolerated dose (MTD) in mice was ≥ 37.5 mg/kg (i.v. or s.c.) and the MTD in monkeys was 11.6 mg/kg (s.c.). In repeated-dose toxicity studies, the basic safety dose in rats and monkeys was 300 μg/kg and ≥ 150 μg/kg, respectively.ConclusionSingle dose every 4 days of rHSA/GCSF administered subcutaneously (s.c.) to the leucopenia on monkeys and mice were caused by radiation, caused by chemical therapeutic on mice, has comparable effect to the merchant rhG-CSF administered a single dose once a day. The study shows that rHSA/GCSF has a long-acting therapeutic function in all of the tested animals. The data obtained from the studies on pharmacodynamics, pharmacokinetics, toxicity and toxicokinetics provide reference and guidance for ongoing clinical trials on cancer patients.

Serum albumin; Granulocyte colony-stimulating factor; Pharmacology; Toxicology; Fusion protein

s:YU Zai-lin, Email: zyu88@yahoo.com; ZUO Cong-lin, Email: zoucl@joinn-lab.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.001

天津市科技支撐計(jì)劃（09ZCKFSH09500）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2007AA021604）；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2009ZX09102-254）

300457 天津溥瀛生物技術(shù)有限公司（富巖、于在林）；100871北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院北大-未名生物技術(shù)聯(lián)合研究室/中關(guān)村開放實(shí)驗(yàn)室（富巖、于在林）；100176 北京昭衍新藥研究中心有限公司（尹麗莉、顧靜良、馬憲梅、左從林）

于在林，Email：zyu88@yahoo.com；左從林，Email：zuocl@joinn-lab.com

2012-07-11

*富巖、尹麗莉?qū)Ρ疚木咄蓉暙I(xiàn)

方法①對(duì) rHSA/GCSF 開展的藥效學(xué)研究?jī)?nèi)容主要有：以恒河猴骨髓細(xì)胞為研究系統(tǒng)，在體外條件下培養(yǎng)骨髓粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落（CFU-GM），計(jì)數(shù)不同濃度的 rHSA/GCSF 對(duì) CFU-GM 數(shù)的影響的體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)；以小鼠60Coγ照射、氟尿嘧啶注射液所致的鼠白細(xì)胞低下和對(duì)60Coγ 射線照射致食蟹猴白細(xì)胞低下的治療作用。②藥理學(xué)研究觀察了 rHSA/GCSF 對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)和狗呼吸及心血管系統(tǒng)功能的影響。③毒理學(xué)研究考察了 rHSA/GCSF 靜脈和皮下給予小鼠、食蟹猴的急性毒性反應(yīng)，以及長(zhǎng)期和反復(fù)給藥對(duì)大鼠和食蟹猴的安全性做出評(píng)價(jià)。④ rHSA/GCSF 的藥代/毒代試驗(yàn)則是對(duì)125I-rHSA/GCSF 不同劑量單次皮下注射給予小鼠、大鼠后，rHSA/GCSF 在各器官的分布、總放射性和 TCA 沉淀放射性的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定，以及對(duì)不同劑量 rHSA/GCSF 連續(xù)給藥食蟹猴后的血漿藥物濃度及代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)開展了考察。

結(jié)果① rHSA/GCSF 可以使骨髓的粒白細(xì)胞系（粒系）增生活躍，骨髓粒系造血細(xì)胞及成熟中性粒細(xì)胞均明顯增多；對(duì)氟尿嘧啶所致小鼠白細(xì)胞減少癥有明顯的治療作用，在使用化療藥早期，可以減緩白細(xì)胞的降低，特別是可以使粒白細(xì)胞提前恢復(fù)到正常水平；rHSA/GCSF 可顯著縮短食蟹猴白細(xì)胞減少癥放療模型產(chǎn)生的白細(xì)胞低下持續(xù)時(shí)間，使外周血白細(xì)胞加速恢復(fù)，尤其以中性粒細(xì)胞的增加為主，同時(shí)對(duì)紅細(xì)胞和血小板的影響不大。②從獲得的 PD/PK 數(shù)據(jù)t1/2來(lái)看：rHSA/GCSF 半衰期平均值約為 38.6 h；單次皮下注射 rHSA/GCSF，在 500、1500、3000 μg/kg 劑量范圍內(nèi)對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)影響，與戊巴比妥鈉無(wú)協(xié)同作用；單次皮下注射 rHSA/GCSF 在 50、200 μg/kg 劑量范圍內(nèi)對(duì)狗呼吸和心血管系統(tǒng)無(wú)明顯影響。實(shí)驗(yàn)表明 rHSA/GCSF單次皮下和靜脈注射給予小鼠的最大耐受量（MTD）≥37.5 mg/kg，單次皮下注射給予食蟹猴的最大耐受劑量為 11.6 mg/kg；長(zhǎng)期反復(fù)給藥對(duì)大鼠的基本安全劑量為300 μg/kg，對(duì)食蟹猴則是 ≥ 150 μg/kg。

結(jié)論rHSA/GCSF 融合蛋白每 4 天給藥 1 次，對(duì)放、化療所致的動(dòng)物外周血白細(xì)胞減少癥具有治療作用，與市售常規(guī) rhGCSF 每天注射 1 次相比具有長(zhǎng)效作用。所獲得的大量藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)、毒代動(dòng)力學(xué)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可供正在開展的臨床試驗(yàn)研究參考，并具有很好的指導(dǎo)意義。

Author Affiliations:Tianjin SinoBiotech Ltd., Tianjin 300457, China (FU Yan, YU Zai-lin); PKU-Bioway Biotech Laboratory/ Zhongguancun Science Park Lab, Peking University College of Life Science, Beijing 100871, China (FU Yan, YU Zai-lin); Beijing Joinn Laboratory Ltd., Beijing 100176, China (YIN Li-li, GU Jing-liang, MA Xian-mei, ZUO Cong-lin)

*FU Yan and YIN Li-li have equal contribution to this paper.

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(4):241-256