閆薈如，李紅娟，楊新玲

0 引言

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種常見于中老年患者的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，遺傳因素在其發(fā)病因素中起著重要作用，LRRK2是重要的易感基因之一。目前已證實(shí)LRRK2基因有20余個(gè)突變位點(diǎn)與PD相關(guān)，突變類型具有明顯的地域和種族差異性。Zheng等［1］和臺灣地區(qū)的Lin等［2］發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與中國漢族人群PD的發(fā)生有關(guān)。目前尚未見國外學(xué)者對S1647T多態(tài)性的研究報(bào)道。新疆維吾爾自治區(qū)地處中亞，維吾爾族具有與漢族不同的遺傳背景，本研究選擇新疆地區(qū)漢族和維吾爾族帕金森患者及健康對照者為研究對象，觀察LRRK2基因S1647T位點(diǎn)多態(tài)性與維吾爾帕金森病發(fā)生的相關(guān)性及不同民族的差異。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)病例組為在流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上收集的PD患者;均為散發(fā)性。對照組為從調(diào)查地點(diǎn)選擇的生活背景與PD患者相似，年齡、性別、民族等相互匹配，并且經(jīng)嚴(yán)格檢查確定無血緣關(guān)系的非PD健康人。以英國BrainBank診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］進(jìn)行篩查，部分診斷困難者再由神經(jīng)內(nèi)科資深專家進(jìn)行審核確診，必要時(shí)行頭顱磁共振或CT掃描輔助診斷［4-5］。發(fā)病年齡以50歲為界分為早發(fā)PD組和晚發(fā)PD組。排除繼發(fā)性PD和帕金森疊加綜合征以及神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病、甲狀腺功能亢進(jìn)、遺傳性疾病等。

1.1.2 一般資料病例組354例，其中漢族183例，維吾爾族171例。漢族患者的男女比例為105∶78，發(fā)病年齡25～85歲，平均(61.9±11.5)歲。維吾爾族患者的男女比例為97∶74，發(fā)病年齡31～95歲，平均(62.1±12.3)歲。健康人對照組340名，其中漢族180名，維吾爾族160名。漢族人男女比例為100∶80，年齡27～86歲，平均(60.9±11.4)歲。維吾爾族人男女比例90∶70，年齡33～90歲，平均(61.1±11.4)歲。漢族和維吾爾族病例組和對照組的性別構(gòu)成(χ2=0.098，P＞0.050、年齡差異(t=1.104，P＞0.05)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 DNA制備取肘靜脈血2 ml按常規(guī)酚/氯仿法抽提基因組DNA，檢測DNA純度為1.7～1.9，濃度≥10 ng/μl，-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI(National Center for Biotechnology Information)及Ensembl數(shù)據(jù)庫中LRRK2基因S1647T所在的Exon34的DNA序列，設(shè)計(jì)S1647T引物。上游引物序列:5′-CTTCTAGGCCACATGGTTG-3′;下游引物序列:5′-TCCTATTGGCAAAGCAATCT-3′。擴(kuò)增片斷長度為326 bp，引物由北京華大生物公司合成。

1.2.3 擴(kuò)增LRRK2基因第34號外顯子PCR總體積為25 μl。100 ng/μl上下游引物各為0.5 μl，MIX 10 μl，50 ng/μl cDNA 3.0 μl，去離子雙蒸水11 μl。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57.8℃退火30 s，72℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測與基因型鑒定取7 μl PCR產(chǎn)物，加入上樣緩沖液混勻后，上樣于2%瓊脂糖凝膠，核酸染料染色，D50 Marker為標(biāo)準(zhǔn)品，4 v/cm電壓電泳20 min，紫外燈下觀察拍照。擴(kuò)增片段長度為326 bp。

1.2.5 RLFP分析酶切反應(yīng)體系體積20 μl，包含PCR產(chǎn)物10μl，10×緩沖液2μl，NspI酶5U，去離子雙蒸水7.5μl，置于37℃恒溫箱中酶切5～24h。取出酶切產(chǎn)物進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光凝膠電泳成像分析系統(tǒng)判斷酶切結(jié)果。D50Marker作為標(biāo)準(zhǔn)品。部分樣本進(jìn)行DNA測序驗(yàn)證。

1.2.6 基因型分析TT型純合子:276 bp+50 bp(野生型);TA型雜合子:326 bp+276 bp+50 bp;AA型純合子:326 bp(純合子突變，無酶切位點(diǎn))。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；蛐皖l率及等位基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比(%)表示，兩組間等位基因頻率和基因型頻率分布的比較采用χ2檢驗(yàn)，基因型及等位基因的影響因素采用多因素Logistic回歸分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗(yàn)病例組與對照組的基因型多態(tài)性分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，吻合度良好。PD組χ2=0.021，P＞0.05，對照組χ2=0.733，P＞0.05。

2.2 LRRK2基因S1647T位點(diǎn)多態(tài)性PCR-RFLP野生型TT基因型分為276bp、50bp 2條帶。雜合子突變TA基因型分為326 bp、276 bp、50 bp 3條帶。純合子突變AA基因型分為326 bp 1條帶。電泳結(jié)果見圖1。測序結(jié)果見圖2，紅色峰為TT基因型，紅綠峰相間為TA基因型，綠色峰為AA基因型。

圖1 LRRK2基因S1647T多態(tài)性的基因分型Figure1Genotypes of S1647T polymorphism in LRRK2 gene

圖2 LRRK2基因S1647T多態(tài)位點(diǎn)測序圖Figure 2 Sequence for S1647T polymorphism of LRRK2 gene

2.3 S1647 T基因型及等位基因頻率分布比較

2.3.1 維吾爾族、漢族PD組和對照組S1647T基因型頻率及等位基因頻率比較漢族PD組TA+AA型基因頻率和A等位基因頻率明顯高于漢族對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.441，P=0.04和χ2=5.389，P=0.02)，A等位基因攜帶個(gè)體發(fā)生PD的風(fēng)險(xiǎn)性高于未攜帶個(gè)體(OR=1.436，95%CI:1.058～1.950);維吾爾族PD組和維吾爾族對照組基因型頻率和等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.10，P=0.577和χ2=0.000，P=0.999)。漢族PD組TA+AA基因型頻率和A等位基因頻率高于維吾爾族PD組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.127，P=0.047和χ2=4.299，P=0.038)，漢族A等位基因攜帶個(gè)體發(fā)生PD的風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=1.387，95%CI:1.018～1.89)。結(jié)果見表1。

2.3.2 PD組和對照組基因型頻率和等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.149，P=0.207和χ2=2.825，P=0.093)。不同年齡PD患者與對照者S1647T基因型頻率和等位基因頻率分布的比較，早發(fā)PD組與≤50歲對照組(χ2=4.485，P=0.106和χ2=3.699，P=0.054)，晚發(fā)PD組與＞50歲對照組(χ2=0.981，P=0.612和χ2=0.773，P=0.379)之間基因型頻率和等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同性別PD患者與對照者S1647T基因型頻率和等位基因頻率分布的比較，男性PD組與男性對照組(χ2=0.464，P=0.793和χ2=0.271，P=0.603)，女性PD組與女性對照組(χ2=4.115，P=0.128和χ2=3.820，P=0.051)基因型頻率和等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.3 Logistic多因素分析在進(jìn)行等位基因的二分類Logistic多因素分析時(shí)，以等位基因(A和T)作為因變量，將可能影響等位基因突變的因素，包括族別、性別、年齡和分組作為自變量，進(jìn)行二分類的多元logistic回歸分析結(jié)果顯示，族別對等位基因A的突變有影響，其他因素均無影響。經(jīng)Wald檢驗(yàn)，不同民族的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.012，說明族別與等位基因A的突變呈正相關(guān)，校正其他自變量的影響后，漢族等位基因A突變的OR(95%置信區(qū)間)為1.841(1.143～2.966)。結(jié)果見表2。

在進(jìn)行基因型的無序多分類Logistic回歸分析時(shí)，將基因型(AA、TT和TA)作為因變量，可能影響到基因型的因素包括族別、性別、年齡和分組作為自變量，進(jìn)行無序多分類logistic多元回歸分析，結(jié)果顯示，族別對AA基因型和TA基因型有影響，其他因素均無影響。族別經(jīng)Wald檢驗(yàn)，P值均小于0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AA基因型相對于TT基因型，漢族發(fā)生基因突變的OR(95%置信區(qū)間)為2.898(1.173～7.163)，P=0.021，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TA基因型相對于TT基因型，漢族發(fā)生基因突變的OR(95%置信區(qū)間)為1.835(1.105～3.047)，P=0.019，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表3。

表1 維吾爾、漢族PD組和對照組S1647T基因型頻率及等位基因頻率比較［n(%)］Table 1 S1647T polymorphism allele and genotype frequency in Xinjiang Uygur and Han nationality，n(%)

表22 等位基因族別、性別、年齡、分組的二分類Logistic回歸分析Table 2 Two alleles of nation，gender，age，group of binary classification Logistic regression analysis

表3 基因型族別、性別、年齡、分組的無序多分類Logistic回歸分析Table 3 The chaos of the gene type more classification Logistic regression analysis of nation，gender，age and group

3 討論

近年來，隨著諸多PD相關(guān)易感基因的發(fā)現(xiàn)，遺傳因素在PD發(fā)病因素中的重要作用日益受到重視。LRRK2基因又名PARK8，位于染色體12q2，全長7584個(gè)堿基，有51個(gè)外顯子，是常染色體顯性遺傳PD中突變頻率最高的致病基因。

LRRK2基因突變具有明顯的地域和種族差異。G2019S和R1441C在歐洲和北非高加索人群中常見［6-8］，在亞洲的突變卻非常少見，僅占LRRK2突變的0.1%左右。Mata等［9］最先報(bào)道G2385R是中國人群中特異的PD風(fēng)險(xiǎn)因子，，隨后其突變研究成為熱點(diǎn)。G2385R在馬來人PD患者中突變頻率為2.0%，但與PD發(fā)病無相關(guān)性，在印度及高加索等其他種族中均未檢出該位點(diǎn)的多態(tài)性［10-12］。然而，在東亞各國和地區(qū)的散發(fā)性PD患者常見該位點(diǎn)突變，突變頻率分別為:中國大陸10%，新加坡7.27%，日本11.6%，臺灣8%［13］。R1628P是新近發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，與G2385R類似，其攜帶者以雜合狀態(tài)為主，是散發(fā)性PD的另一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素［14］。Ross等［15］報(bào)道R1628P可能是中國人群中第二個(gè)特異的PD風(fēng)險(xiǎn)因子，與G2385R不同的是，在亞洲其他種族中未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變，是漢族人群特異性的突變位點(diǎn)。

S1647T是除G2385R和R1628P之外又發(fā)現(xiàn)的與中國漢族PD發(fā)生有關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)。目前對該位點(diǎn)研究不多，Zheng等［1］研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的A等位基因增加中國華南地區(qū)漢族人群PD的患病風(fēng)險(xiǎn)。臺灣的Lin等［2］研究證實(shí)S1647T多態(tài)協(xié)同環(huán)境因素致使人群的PD患病增加。同時(shí)Chang等［16］研究結(jié)果也表明S1647T位點(diǎn)的突變增加了中國漢族人群PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。目前尚未見國外學(xué)者對該位點(diǎn)的研究報(bào)道。在新疆地區(qū)不同民族間進(jìn)行LRRK2基因多態(tài)性與PD易患性的研究有助于進(jìn)一步揭示人類罹患PD的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，為PD基因診斷及治療提供新途徑。

不同種族和地域PD患者的致病基因、突變位點(diǎn)及其表型均有所不同。本研究結(jié)果顯示，LRRK2基因S1647T多態(tài)性以TT和TA基因型多見，AA基因型較少見。A等位基因頻率在漢族PD組與漢族對照組之間存在差異，提示A等位基因可能增加了新疆地區(qū)漢族人群散發(fā)性PD的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，這與Zheng等和Chang等文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論一致。而維吾爾族PD組和維吾爾族對照組基因型頻率和等位基因頻率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于LRRK2基因突變類型存在明顯的種族及地域差異，新疆地區(qū)地處中亞，維吾爾族具有與漢族不同的遺傳背景，該研究說明S1647T不大可能與新疆維吾爾族人群PD的發(fā)生有關(guān)，是中國漢族人群的突變熱點(diǎn)。按年齡分組，該研究表明S1647T位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率在早發(fā)PD組和≤50歲對照組、晚發(fā)PD組和＞50歲對照組、早發(fā)PD組和晚發(fā)PD組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Chang等［15］研究證明的與早發(fā)型PD有關(guān)結(jié)論不同，該研究A等位基因頻率在早發(fā)PD組為40.3%，大于晚發(fā)PD組(34.5%)和≤50歲對照組(29.6%)，這與樣本量不足、抽樣誤差以及Chang等的研究對象主要來自四川有關(guān)，不同地區(qū)、種族、環(huán)境及生活習(xí)俗的差異可能導(dǎo)致不同的結(jié)果。

基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。本研究在新疆地區(qū)進(jìn)行LRRK2基因多態(tài)性的研究填補(bǔ)了國內(nèi)外不同民族、地區(qū)PD患者LRRK2基因多態(tài)性研究的空白。所獲數(shù)據(jù)表明S1647T多態(tài)性與新疆地區(qū)漢族人群PD發(fā)生具有相關(guān)性，與維吾爾族人群PD的發(fā)生可能無關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了LRRK2基因突變的地域和種族差異性。今后有必要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量在其他地區(qū)和民族人群中對該位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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