張民皓，張紅，胡玉萍，劉清珍，李偉偉，胡益民，李偉彥

0 引言

NSC作為一種神經(jīng)組織特異性前體細胞，來源豐富，增殖、分化能力強，能整合于宿主細胞，易于基因修飾，極低或無免疫源性，無致瘤性等，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的理想載體［1］。NSC分泌的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NF)對神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育和成熟有重要的影響，如神經(jīng)元存活、軸突生長、突觸可塑性和神經(jīng)傳遞等，其中GDNF可能參與了神經(jīng)損傷后修復(fù)過程并發(fā)揮重要作用［2］。有研究提示，移植到體內(nèi)的NSC可以向病灶處遷移并促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷動物的神經(jīng)功能恢復(fù)［3］。一般治療病理性疼痛方法很多，如某些藥物［4-5］、補體活化途徑［6］等，但通過移植NSC治療神經(jīng)病理性疼痛的研究還罕見報道。本研究通過觀察鞘內(nèi)移植NSC后坐骨神經(jīng)CCI大鼠痛閾及脊髓背角、DRG GDNF的蛋白和mRNA表達變化，探討NSC對大鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用。

1 材料與方法

1.1 NSC的制備、培養(yǎng)和鑒定出生1 d的SD乳鼠(由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供)按照無菌條件下取出全腦，眼科鑷取海馬，用膠頭滴管吹打成細胞懸液，用DMEM/F12(1∶1)的無血清培養(yǎng)基［內(nèi)含堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)20 μg/L，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)20 μg/L，B27 20μl/L，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素(1×105U/L)和鏈霉素1×105μg/ml］重懸細胞，置37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。至第3代神經(jīng)細胞球形成時，行神經(jīng)上皮干細胞蛋白(Neuoepithelial Stem Cell Protein，Nestin)免疫熒光染色，同時用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液對神經(jīng)細胞球進行誘導(dǎo)分化，然后以神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的特異性標記物神經(jīng)絲微管蛋白(tubulin)及神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)進行免疫細胞化學染色。

1.2 動物模型的建立及分組72只4～5周雄性SD大鼠，體重100～150g，飼養(yǎng)環(huán)境:清潔級、溫度23℃、濕度50%、給予充足的食物和水源、12h明暗交替，術(shù)前禁食12h，不禁水，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供，許可證號:(軍)2007-012，使用許可證:SYXK(軍)2007-029。隨機均分為3組，A組(假手術(shù)+細胞培養(yǎng)液)、B組(CCI+細胞培養(yǎng)液)和C組(CCI+NSC)，然后各組再隨機分為:A1、B1和C1組(CCI后3d鞘內(nèi)移植組)和A2、B2和C2組(CCI后10d鞘內(nèi)移植組)。B、C組參照Bennett和Xie［7］的方法制作CCI模型，A組僅暴露坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎。

1.3 鞘內(nèi)移植模型和細胞移植將第3代懸浮培養(yǎng)的NSC懸液，調(diào)整細胞濃度為1×106/30 μl，參照Mestre等人所建立的方法［8］，采用微量進樣器，分別于術(shù)后第3天、第10天，實驗組注入30 μl的細胞懸液，空白組和對照組注入30 μl的細胞培養(yǎng)液。

1.4 機械痛閾和熱痛閾的測定大鼠分別與術(shù)前1 d和術(shù)后1、3、7、14、21 d以機械測痛儀(Model 2390CE，ⅡTC Life Science Inc，美國)和熱痛儀(Model 390，ⅡTC Life Science Inc，美國)測定MWT和TWL。

1.5 免疫組化染色大鼠在術(shù)后第7、14和21天測痛閾后，戊巴比妥腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注固定后，取右側(cè)腰膨大脊髓背角及L5 DRG，常規(guī)固定，石蠟包埋。以ABC法作GDNF免疫組織化學染色，0.5%H2O2甲醛避光封閉15 min，PBS沖洗，抗原修復(fù)后加10%正常羊血清封閉30 min;鼠抗GDNF兔抗血清(1∶1000)，濕盒內(nèi)孵育1h，4℃過夜;生物素化IgG(1∶200)及ABC復(fù)合物(1∶100)濕盒內(nèi)孵育各1 h;行DAB顯色。400倍光鏡下觀察。

1.6 Real-time PCR檢測

1.6.1 總RNA的抽取術(shù)后第7、14、21天在戊巴比妥麻醉下，取右側(cè)脊髓及L5DRG，-70℃凍存。用總RNA抽提試劑盒(Invitrogen life technologies，美國)提取L5DRG總RNA，分光光度法對RNA的質(zhì)和量鑒定。

1.6.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)總體積20 μl。退火混合物15.5 μl，包括RNA 2 μg，0.5 μg/μl Oligo dT 1 μl，dNTPs 1 μl，加無RNA酶的H2O至總體積15.5 μl;RT反應(yīng)液4.5 μl包括10×RT緩沖液2 μl，DTT 1 μl，RNA酶抑制劑0.5 μl，莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶1μl。加4.5μl的RT反應(yīng)液到15.5μl退火混合物中，37℃水浴60 min，70℃保溫15 min，得到的RT終溶液即為cDNA溶液。

1.6.3 實時定量PCR擴增25 μl反應(yīng)體系包括2×Rtmix 12.5 μl，模板(cDNA稀釋10倍)1 μl，5μmol/L的PCR上下游特異引物1 μl，加水至總體積25μl，以梯度稀釋標準模板作為標準曲線，在Rotor-Gene3000 Realtime PCR儀中擴增。引物用Primer 5.0軟件設(shè)計，GDNF上游引物5′-AAATCGGGGGTGCGTCTTAACT-3′，下游引物5′-AACATGCCTGGCCTACCTTGTC-3′，PCR產(chǎn)物長度194bp;β-Actin上游引物5′-GCAGAAGGAGATCACAGCCCT-3′，下游引物5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′，PCR長度136bp。反應(yīng)條件:β-Actin:95℃，5 min;40個PCR循環(huán)(95℃，30s;60℃，30s;72℃，30s;72℃10min)。GDNF:95℃，5min;40個PCR循環(huán)(95℃，30s;60℃，30s;72℃，30s;72℃10min)。電泳圖證實PCR擴增的特異性，經(jīng)分析軟件得到樣品的Ct值和相應(yīng)的拷貝數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示，各組MWT值、TWL值和GDNF mRNA和蛋白表達的組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NSC培養(yǎng)及鑒定結(jié)果原代培養(yǎng)第3代的神經(jīng)球，細胞形態(tài)規(guī)則，折光性強。取第3代的NSC行nestin檢測，85%以上均成陽性反應(yīng)，經(jīng)胎牛血清誘導(dǎo)分化后，能夠向膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元方向分化。見圖1。

圖1 NSC培養(yǎng)及鑒定結(jié)果(×100)Figure 1 Results of cultivation and identification of NSCs(×100)

2.2 痛閾值的變化與A1組比較，B1、B2、C1、C2組大鼠術(shù)前1 d、術(shù)后1 d和21 d MWT和TWL值差異無統(tǒng)計學意義，術(shù)后3、7、14 d MWT和TWL均降低，其中7 d閾值最低(P＜0.01)。與B1組比較，C1組術(shù)后7 d、14 d MWT和TWL明顯上升(P＜0.01)。與B2組比較，C2組術(shù)后14 d MWT和TWL明顯上升(P＜0.01)。與C1組比較，術(shù)后7、14 d C2組MWT和TWL較低(P＜0.01)，見表1。

2.3 免疫組化分析免疫組化結(jié)果顯示，術(shù)后7 d、14 d、21 d GDNF在A組和B組大鼠脊髓和DRG中陽性細胞較少，移植NSC后C組陽性細胞表達明顯增多，之后隨時間推移逐漸減少。見圖2、3。

表1 大鼠MWT和TWL的變化(x±s)Table 1 Changes of MWT and TWL in rats(x±s)

圖2 術(shù)后7 d、14 d和21 d各組大鼠脊髓背角GDNF的蛋白表達(免疫組化法×400)Figure 2 Expressions of GDNF protein in the cornu dorsal medullae spinalis in different groups rats at 7，14 and 21d postoperatively(immunohistochemical stain×400)

圖3 術(shù)后7 d、14 d和21 d各組大鼠DRG GDNF的蛋白表達(免疫組化×400)Figure 3 Expressions of GDNF protein in the DRG in different groups rats at 7，14 and 21d post-operatively(immunohistochemical stain×400)

2.4 GDNF mRNA的表達變化GDNF和β-actin的PCR擴增產(chǎn)物的融解曲線顯示兩者都是單一峰型的曲線，無引物二聚體產(chǎn)生(圖4、圖5);證明擴增的PCR產(chǎn)物為特異性目的基因。擴增曲線呈明顯的“S”型，說明用此引物通過熒光定量RT-PCR測定大鼠GDNF敏感性好(圖6)。與B組比較，A組術(shù)后7、14 d和21 d各組大鼠脊髓背角、背根神經(jīng)節(jié)GDNF的表達呈低水平(P＜0.05);術(shù)后7 d，C1組脊髓背角和DRG中GDNF的表達量較B1組明顯升高(P＜0.05);術(shù)后14 d和21 d，C1、C2組脊髓背角和DRG中GDNF的表達量高于B1、B2組(P＜0.05)，見圖7。

圖4 GDNF溶解曲線Figure 4 GDNF solubility curve

圖6 GDNF熒光定量擴增曲線Figure 6 Fluorescent quantitative amplification curve

3 討論

CCI模型可測試傷害性的熱刺激和機械刺激所引發(fā)的痛覺過敏及冷和觸覺的痛覺異常，神經(jīng)結(jié)扎后3～5d開始出現(xiàn)痛反應(yīng)，7～10d達高峰，持續(xù)21d左右疼痛反應(yīng)表現(xiàn)逐漸減退［9］。本實驗在術(shù)后3 d和10 d進行鞘內(nèi)移植NSC，意在探討NSC在預(yù)防和治療神經(jīng)病理性疼痛中所起的作用。

本實驗觀察到與A組比較，B、C組術(shù)前1 d、術(shù)后1 d無明顯改變，而術(shù)后第3 d開始出現(xiàn)顯著的MWT和TWL的下降，痛覺增敏，持續(xù)至術(shù)后14、21 d后恢復(fù)正常，與以往的研究結(jié)果一致［13］，說明模型穩(wěn)定可靠。與B1組比較，C1組術(shù)后7、14 dMWT和TWL明顯上升。與B2組比較，C2組術(shù)后14d MWT和TWL明顯上升。與C1組比較，術(shù)后7、14 d C2組MWT和TWL較低。以上結(jié)果表明，在大鼠神經(jīng)損傷的前后時間點給予NSC進行防治，效果顯著，說明鞘內(nèi)移植NSC可以明顯抑制疼痛的發(fā)生和發(fā)展。

圖5 β-actin溶解曲線Figure 5 β-actin solubility curve

圖7 GDNF在DRG和脊髓背角的表達Figure 7 Expression of GDNF in the DRG and cornu dorsale medullae spinalisA1、C1組與B1組比較，#P＜0.05;A2、C2與B2組比較，*P＜0.05

多項研究已證實，NSC可有效促進損傷動物的神經(jīng)功能恢復(fù)，然而其確切機制仍不甚明確，目前有2種主要假說，即替代學說和營養(yǎng)學說。替代學說認為，移植的NSC在病灶處分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞，替代原有壞死的神經(jīng)細胞，從而促進神經(jīng)功能恢復(fù)，但缺乏有力的證據(jù)證明移植的NSC可整合入宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，因此單純的替代學說尚不能解釋NSC的修復(fù)機制。營養(yǎng)學說目前受到研究者的普遍關(guān)注，認為移植的NSC通過分泌或調(diào)節(jié)某種或幾種NIF來促進損傷后神經(jīng)功能的修復(fù)。本實驗中，通過RT-PCR反應(yīng)觀察GDNF的mRNA表達變化，發(fā)現(xiàn)B、C組各數(shù)值普遍升高，且C組較B組升高明顯;免疫組化結(jié)果顯示，GDNF在A組和B組大鼠脊髓和DRG中陽性細胞較少，移植NSC后C組陽性細胞表達明顯增多，之后隨時間推移逐漸減少。GDNF是轉(zhuǎn)化生長因子-B超家族的一員［10］，對神經(jīng)細胞的生存、增殖及分化具有重要作用的神經(jīng)營養(yǎng)因子［11］。GDNF通過其特異的高親和力受體GFRα-1和Ret依賴性信號通路及Ret非依賴性信號通路介導(dǎo)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮生物學效應(yīng)，在痛覺信號傳導(dǎo)和調(diào)制中起重要作用，促進損傷神經(jīng)元存活的同時，降低其異位放電率，阻止神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生;有學者報導(dǎo)GDNF可能在痛覺信號傳導(dǎo)和調(diào)制中起重要作用，外源性給予GDNF能夠減輕疼痛，減少痛敏的發(fā)生［12-13］。

我們推測:GDNF參與了坐骨神經(jīng)損傷引起的脊髓損傷再生增強過程，有效的促進了神經(jīng)損傷的修復(fù)。本實驗中，C組大鼠術(shù)后出現(xiàn)痛閾下降，同時DRG和脊髓背根中GDNF的表達增高，提示鞘內(nèi)移植的NSC通過分泌或調(diào)節(jié)顯著提高GDNF的表達，從而抑制了周圍神經(jīng)損傷產(chǎn)生的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展。

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