李 麗，王長(zhǎng)山，吳玉斌

0 引 言

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎病發(fā)展至終末期腎功能衰竭的共同通路和重要原因［1］。迄今為止，許多學(xué)者通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化雖進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚未完全闡明。目前認(rèn)為腎小管上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在該過(guò)程中發(fā)揮重要作用［2］。UUO引起的腎梗阻是誘導(dǎo)腎纖維化最經(jīng)典的模型［3］。

PAX2(Paired Box2)基因編碼核轉(zhuǎn)錄因子，是腎胚胎發(fā)育過(guò)程中誘導(dǎo)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal epithelial transition，MET)的關(guān)鍵性基因，參與胚胎腎發(fā)育各個(gè)階段的調(diào)控［4］。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，PAX2在病理腎中重新表達(dá)［5］。Cohen等［6］研究發(fā)現(xiàn)PAX2在小鼠UUO模型腎集合管再表達(dá)，并與集合管的細(xì)胞凋亡有關(guān)。我們前期的工作證實(shí)PAX2在大鼠UUO模型腎小管上皮細(xì)胞存在重新表達(dá)，與腎間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)，PAX2基因通過(guò)哪些途徑作用于EMT，而促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制尚不明確［7］。因此，設(shè)想通過(guò)抑制PAX2的轉(zhuǎn)錄活性及其功能來(lái)探討其與腎間質(zhì)纖維化的聯(lián)系是我們研究的焦點(diǎn)。

RNAi是在生物體內(nèi)由外源性或內(nèi)源性小分子雙鏈(RNA double stranded RNA，dsRNA)引起同源性mRNA特異性降解，從而引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一種現(xiàn)象［8］。RNAi技術(shù)具有高度特異性、高效性及低毒性等特點(diǎn)，目前，已有應(yīng)用PAX2 siRNA治療腎細(xì)胞癌的研究［9］，但關(guān)于大鼠PAX2的RNAi在纖維化方面研究未見(jiàn)報(bào)道。由于針對(duì)同一靶基因的不同位點(diǎn)siRNA往往具有不同的沉默效率，因此，需進(jìn)行靶位點(diǎn)的選擇和優(yōu)化，通常需設(shè)計(jì)至少3～4對(duì)siRNA，在其中篩選出效率最高的片段［10］。本研究采用RNAi方法，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，為了防止siRNA被降解，本實(shí)驗(yàn)將利用UUO術(shù)后3 d模型，設(shè)計(jì)、篩選和鑒定出針對(duì)PAX2基因的沉默效果最佳siRNA，特異性抑制大鼠UUO模型中PAX2基因及其蛋白的表達(dá)，為深入研究腎纖維化的發(fā)病機(jī)制提供新的手段，為腎纖維化基因治療開(kāi)辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料雄性SPF級(jí)4～6周Wistar大鼠60只，體重120～150 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(遼)2003-0019。Trizol總RNA提取液購(gòu)于Invitrogen公司。PAX2兔抗大鼠單克隆抗體(一抗)購(gòu)于美國(guó)Zymed公司。β-actin一抗和HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz。Real time quantitive PCR引物由TaKaRa大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。PrimeScriptTMRT Reagent Kit和Real time quantitive PCR(SYBRRPremix Ex TaqTM)試劑盒購(gòu)于TaKaRa大連寶生物工程有限公司。蛋白裂解液購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。2'F修飾siRNA，由上海吉瑪公司化學(xué)修飾合成。in vivo-jetPEI購(gòu)于PolyPlus Transfection公司。脫脂奶粉購(gòu)于完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA設(shè)計(jì)合成首先從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取大鼠PAX2基因編碼序列全長(zhǎng)(GeneID:293992，mRNA:NM_001106361)，上海吉瑪公司利用siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)4對(duì)干涉靶點(diǎn)和隨機(jī)的不靶向任何基因的陰性對(duì)照，同時(shí)合成1對(duì)FAM標(biāo)記陰性對(duì)照，通過(guò)NCBI上的BLAST將潛在的siRNA靶位點(diǎn)序列和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，確保與其他基因沒(méi)有同源性，為增強(qiáng)穩(wěn)定性和特異性，選擇2'F修飾長(zhǎng)度為21 bp、3'端2個(gè)堿基突出的siRNA，由上海吉瑪公司化學(xué)修飾合成。siRNA序列見(jiàn)表1。

1.2.2 制作UUO動(dòng)物模型20只Wistar大鼠分為假手術(shù)組(sham組)和模型組(UUO組)，每組10只。UUO組以10%的水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，行左側(cè)恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左輸尿管，用4-0號(hào)絲線上下結(jié)扎2處，從中剪斷輸尿管以防逆行感染，分層縫合關(guān)閉腹腔。sham組分離輸尿管不結(jié)扎，隨即縫合腹腔。大鼠于術(shù)后3 d處死，取左側(cè)腎，置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，待做病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.2.3 病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)及鑒定①腎小管間質(zhì)損傷程度判定:常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腎間質(zhì)纖維化、蛋白管型、腎小管擴(kuò)張和腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度判定腎小管間質(zhì)損傷的程度。每個(gè)參數(shù)分為4個(gè)等級(jí):0分為正常，1分為輕度受損，2分為中度受損，3分為重度受損，每個(gè)樣本腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分總分為0～9分［11］。②腎間質(zhì)纖維化定量分析:常規(guī)Masson染色，借助Image Proplus多媒體彩色病理圖像軟件定量分析腎間質(zhì)纖維化程度。根據(jù)文獻(xiàn)方法［12］，每例切片取10個(gè)不重復(fù)的400倍視野，以藍(lán)色膠原沉積為陽(yáng)性，計(jì)算藍(lán)染面積占整個(gè)視野的百分比，得出腎間質(zhì)膠原面積與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積(去除腎小管管腔)的比值，取其平均值為每例切片的腎間質(zhì)相對(duì)面積。

表1 siRNA序列Table 1 siRNA sequences

1.2.4 體內(nèi)轉(zhuǎn)染PAX2-siRNA(4個(gè)沉默點(diǎn)和FAM標(biāo)記、未標(biāo)記的陰性對(duì)照)與in vivo jetPEITM(N/P=5)復(fù)合物的配制嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行，終體積均為200μl。將80μg siRNA粉末離心后加入5%葡萄糖100μl，充分混合;取8μl in vivo-jetPEITM加入5%葡萄糖92μl，充分混合;100μl in vivo-jet-PEITM立刻加入到100μl siRNA液體中(注意次序不能顛倒);室溫孵育15 min;在制作模型后，立即將裝有200μl PAX2-siRNA-invivo jetPEI復(fù)合物的微量注射器分別沿腎外緣上下極和腎兩側(cè)的中央4個(gè)注射點(diǎn)(每點(diǎn)50μl)注入腎被膜下，分層縫合關(guān)閉腹腔。根據(jù)siRNA的位點(diǎn)不同分為5組(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4和陰性對(duì)照組，每組8只，大鼠于注射3 d后處死，取左側(cè)腎，分離腎皮質(zhì)和髓質(zhì)，待進(jìn)一步檢測(cè)。

1.2.5 PAX2-siRNA-PEI腎內(nèi)轉(zhuǎn)染的鑒定PAX2-FAM-siRNA-PEI和PAX2-NC-siRNA-PEI腎內(nèi)轉(zhuǎn)染3 d后立即取左腎，OTC包埋，制作厚度為5μm冰凍切片(冷凍切片機(jī)LEICA，德國(guó))，采用熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)觀察綠色熒光在腎的分布情況。

1.2.6 Real-time PCR檢測(cè)PAX2 m RNA表達(dá)取5組大鼠腎皮質(zhì)100 mg，采用Trizol(Invitrogen試劑公司提供)試劑，按說(shuō)明書進(jìn)行操作。用紫外分光光度計(jì)測(cè)260 nm/280 nm的吸光度比值及樣本濃度，檢測(cè)提取的RNA產(chǎn)量及質(zhì)量。RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，經(jīng)37℃15 min，85℃5 s，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板用PAX2(mRNA:NM_001106361)引物經(jīng)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

擴(kuò)增條件為:95℃10 s，95℃5 s，60℃34 s，共40個(gè)循環(huán)。融解曲線條件(ABI7500機(jī)器自行設(shè)定):95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。每個(gè)基因以預(yù)實(shí)驗(yàn)中Ct值最大的樣品作為其標(biāo)準(zhǔn)品，用EAZY Dilution依次稀釋成4個(gè)梯度，與樣品同時(shí)擴(kuò)增。應(yīng)用ABI 7500 real-time PCR system(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)熒光定量PCR儀根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)分析并顯示結(jié)果，用△△CT法［13］進(jìn)行計(jì)算。

1.2.7 W estern blot檢測(cè)PAX2蛋白表達(dá)取5組大鼠腎皮質(zhì)100 mg，加入裂解液500μl研磨，取出置EP管中，12000 r/min 4℃離心10 min，取上清液用BCA法檢測(cè)樣品蛋白質(zhì)含量。50μg蛋白于SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉4℃過(guò)夜，加PAX2(1∶500)以及內(nèi)參β-actin(1∶500)37℃2 h;TBST洗膜3次，每次10 min;加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶2000，美國(guó)Santa Cruz提供)，37℃2 h，洗膜;將適量DAB顯色液平鋪在二抗雜交后的膜上，室溫避光放置，約3 min后可出現(xiàn)明顯的棕褐色蛋白顯色帶。半定量方法分析腎皮質(zhì)PAX2表達(dá)，將膜上條帶掃描存入電腦，應(yīng)用Quantity One-4.4.0凝膠成像分析軟件分析，記錄每條帶的灰度值，結(jié)果用β-actin校正。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，兩獨(dú)立組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，2組方差不齊(P＜0.10)時(shí)用校正t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腎組織形態(tài)學(xué)改變

2.1.1 腎大體觀察UUO組大鼠腎體積增大，灰白色、無(wú)光澤，表面不光滑，顆粒感明顯，腎盂擴(kuò)張，明顯腎積水，腎盞乳頭受壓;sham組大鼠腎呈深紅色，表面光滑，包膜完整，與腎實(shí)質(zhì)不粘連，切面皮髓分界清晰。見(jiàn)圖1。

2.1.2 光鏡下腎病理改變采用HE染色觀察，UUO組可見(jiàn)腎間質(zhì)水腫，腎小管擴(kuò)張，小管間質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);腎小球未見(jiàn)明顯病變;sham組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)正常、排列緊密整齊，間質(zhì)未見(jiàn)增寬，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小管基膜光滑完整;2組腎小管損傷程度評(píng)分比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

圖1 腎組織的大體觀察Figure 1 M acroscopic observation of the rat kidneys in the sham-operation and UUO groups

圖2 光鏡下腎病理改變(HE×400)Figure 2 Pathological changes of the rat kidneys in the sham-operation and UUO groups under the light m icroscope(HE×400)

2.1.3 腎間質(zhì)纖維化改變采用Masson染色觀察，UUO組可見(jiàn)腎間質(zhì)增寬，膠原沉積，間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分增多;sham組腎膠原染色主要位于小管基膜、腎小囊、系膜區(qū)和腎小管間的毛細(xì)血管周圍，而小管周圍間質(zhì)染色較少。UUO組腎間質(zhì)相對(duì)面積較sham組增高(P＜0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 腎間質(zhì)纖維化改變(M asson×400)Figure 3 Renal interstitial fibrosis changes in the sham-operation and UUO groups(M asson×400)

表3 各組大鼠腎小管損傷程度和腎間質(zhì)相對(duì)面積比較(±s)Table 3 Renal tubular injury and relative area of renal interstitia in the sham-operation and UUO groups(±s)

表3 各組大鼠腎小管損傷程度和腎間質(zhì)相對(duì)面積比較(±s)Table 3 Renal tubular injury and relative area of renal interstitia in the sham-operation and UUO groups(±s)

與sham組比，*P＜0.05

組 別 n 腎小管損傷評(píng)分(分)腎間質(zhì)相對(duì)面積(%)sham組10 0.11±0.03 1.77±0.23 UUO組 10 2.50±0.27* 7.31±1.03*

2.2 PAX2-siRNA-PEI在腎組織內(nèi)轉(zhuǎn)染情況FAM-siRNA-PEI和NC-siRNA-PEI注射體內(nèi)3 d后取腎，立即制作冰凍切片，放置于熒光顯微鏡下觀察，注射FAM-siRNA-PEI的腎內(nèi)可見(jiàn)腎小管周圍存在綠色熒光(圖4b)，注射NC-siRNA-PEI的腎未見(jiàn)熒光(圖4a)。

圖4 熒光顯微鏡觀察腎組織冰凍切片(×400)Figure 4 Fluorescence microscopy of the rat renal tissues(×400)

2.3 Real-time PCR檢 測(cè)PAX2-siRNA-PEI對(duì)PAX2 mRNA的抑制效果同等劑量的4對(duì)化學(xué)合成的PAX2-siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)和陰性對(duì)照siRNA與in vivo jetPEI復(fù)合物轉(zhuǎn)染UUO鼠體內(nèi)3 d后取腎皮質(zhì)，進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。PAX2和GAPDH溶解曲線的溶解溫度一致，說(shuō)明產(chǎn)物特異，無(wú)引物二聚體和其他非特異性產(chǎn)物;通過(guò)擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的CT值，用2-△△CT法計(jì)算，結(jié)果轉(zhuǎn)染后4對(duì)PAX2-siRNA-PEI腎皮質(zhì)PAX2 mRNA的表達(dá)均有不同程度的抑制作用，分別為siRNA126%、siRNA248%、siRNA355%、siRNA445%。其中PAX2-siRNA3位點(diǎn)抑制效果最明顯，說(shuō)明PAX2-siRNA3是抑制PAX2 mRNA水平表達(dá)的最佳位點(diǎn)。見(jiàn)表4、圖5。

表4 不同沉默位點(diǎn)siRNA對(duì)PAX2 m RNA和蛋白表達(dá)的影響(±s)Table 4 Expressions of PAX2 mRNA and protein inhibited by siRNA interference sequences(±s)

表4 不同沉默位點(diǎn)siRNA對(duì)PAX2 m RNA和蛋白表達(dá)的影響(±s)Table 4 Expressions of PAX2 mRNA and protein inhibited by siRNA interference sequences(±s)

mRNA/protein n NC siRNA4 siRNA3 siRNA2 siRNA 1 2-△△CT 8 1 0.55±0.037 0.45±0.031 0.52±0.045 0.74±0.051 PAX2/β-actin 8 1 0.505±0.031 0.19±0.023 0.92±0.0 35 0.93±0.037

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PAX2 m RNA的表達(dá)Figure 5 Real-time quantitative PCR analysis of the PAX2 m RNA expression

2.4 W estern blot檢測(cè)PAX2-siRNA-PEI對(duì)PAX2蛋白的抑制效果免疫印跡法雜交結(jié)果顯示，5條泳道均在43 000和46 000處各出現(xiàn)一條帶，與預(yù)期的內(nèi)對(duì)照β-actin和PAX2蛋白產(chǎn)物相吻合，說(shuō)明兩者均為特異性蛋白條帶。其中β-actin條帶的亮度相似，而PAX2條帶的亮度各不相同，以陰性對(duì)照組PAX2蛋白相對(duì)表達(dá)量為100%，siRNA3組蛋白相對(duì)表達(dá)量減少了81%，抑制效果明顯(P＜0.01)，這與Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果一致。見(jiàn)表4、圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)不同沉默位點(diǎn)siRNA對(duì)PAX2蛋白表達(dá)的影響Figure 6 W estern blot analysis of the expressions of PAX2 andβ-actin proteins in the model rats transfected w ith different PAX2-siRNAs

3 討 論

RNAi作為一種新的基因阻斷技術(shù)，具有高度特異性、高效性，高穩(wěn)定性、低毒性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為研究基因功能的重要工具［15］。RNAi是通過(guò)雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)特異性的誘導(dǎo)與之同源互補(bǔ)的mRNA降解而高效地阻斷基因表達(dá)，從而引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄后水平沉默的現(xiàn)象［14］。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)度為21 bp并且3'端有2個(gè)堿基突出的siRNA可以有效且特異性地引起哺乳動(dòng)物的基因沉默［16］。體外化學(xué)合成的siRNA是應(yīng)用最早、也是最經(jīng)典的合成方法，其具有操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)時(shí)間短、得到的siRNA純度和質(zhì)量高、易標(biāo)記以追蹤其在體內(nèi)的活動(dòng)狀況、對(duì)細(xì)胞的或者組織的毒副作用小、可大規(guī)模制備等優(yōu)點(diǎn)。未經(jīng)修飾的裸siRNA在體內(nèi)容易被降解，半衰期短，無(wú)法維持有效藥物濃度，為此需對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾。通過(guò)化學(xué)修飾的siRNA，可以提高活性和穩(wěn)定性［17］、減少副作用和“脫靶”效應(yīng)［18］，同時(shí)增強(qiáng)對(duì)血清RNA酶的抵抗性［19］。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)合成法選擇長(zhǎng)度為21 bp、3'端有2個(gè)堿基突出，同時(shí)2'F修飾的PAX2-siRNA，既增強(qiáng)siRNA體內(nèi)穩(wěn)定性，又保證了作用的特異性，增加RNAi在動(dòng)物體內(nèi)的干擾效果。

近幾年RNAi已經(jīng)廣泛應(yīng)用于哺乳細(xì)胞體外研究，隨著研究的深入，如何把siRNA導(dǎo)入試驗(yàn)動(dòng)物或是人體內(nèi)研究卻遇到一定困難，其中一個(gè)主要的挑戰(zhàn)就是如何將siRNA安全而高效地遞送到體內(nèi)特定的靶器官或靶細(xì)胞［20］。目前用于基因治療的載體可以分為2類:病毒性載體和非病毒性載體［21］。病毒性載體包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體等，病毒載體具有潛在毒性，如免疫原性可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生某種程度的免疫反應(yīng)［22］、病毒基因產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞有一定的毒性、病毒基因組可能會(huì)隨機(jī)整合入宿主基因從而使宿主基因表達(dá)異常等［23］;并且病毒載體制備復(fù)雜、生產(chǎn)困難、不適于體內(nèi)重復(fù)應(yīng)用;另外病毒具有自我復(fù)制的功能，故人們對(duì)使用病毒的安全性存在顧慮。為了避免病毒載體的種種不利之處，人們開(kāi)始致力于非病毒性載體的研究［24］。相對(duì)來(lái)說(shuō)，非病毒載體無(wú)傳染性及免疫原性、易于構(gòu)建、可大量制備、穩(wěn)定性好、安全性較高、使用方法簡(jiǎn)單易行等優(yōu)點(diǎn)。在非病毒性載體中，陽(yáng)離子聚合物多聚乙酰亞胺(polyethylenimine，PEI)是公認(rèn)的體內(nèi)外有效的傳遞基因和RNAi的轉(zhuǎn)運(yùn)工具［25-27］，已被廣泛用于多種器官［28-29］，同時(shí)PEI具有相當(dāng)高效的轉(zhuǎn)染率［30］。此外，Bolcato-Bellemin研究顯示在體內(nèi)外PEI可有效的凝集、穩(wěn)定傳遞化學(xué)修飾的siRNA［31］。本實(shí)驗(yàn)選用in vivo jetPEI體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑與化學(xué)修飾siRNA形成復(fù)合物，以增加轉(zhuǎn)染率。為了有效的觀察轉(zhuǎn)染效果，選擇FAM標(biāo)記的siRNA與in vivo jetPEI結(jié)合注射到UUO大鼠腎被膜下，通過(guò)熒光顯微鏡已觀察到在腎小管周圍綠色熒光，說(shuō)明采用大鼠腎被膜下注射PAX2-siRNA-PEI復(fù)合物可到達(dá)腎實(shí)質(zhì)，從而為RNAi在動(dòng)物腎的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

UUO模型具有制作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、成功率高、腎間質(zhì)纖維化發(fā)生迅速的優(yōu)點(diǎn)，是誘導(dǎo)腎纖維化最經(jīng)典的模型，在梗阻3 d時(shí)即出現(xiàn)纖維化改變［3］。在本研究中，通過(guò)HE和Masson染色觀察到尿路梗阻后腎纖維化表現(xiàn):腎間質(zhì)彌漫性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)增寬、膠原纖維的沉積等。證明本實(shí)驗(yàn)UUO模型造模成功。

目前siRNA的設(shè)計(jì)多采用軟件設(shè)計(jì)或從既有文獻(xiàn)中獲得。大鼠PAX2的RNAi方面研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。Yoshinari等［32］研究認(rèn)為siRNA的序列起始位置錯(cuò)后1個(gè)或2個(gè)堿基，其抑制效果也大大降低，因此設(shè)計(jì)有效的siRNA是實(shí)驗(yàn)成功的一個(gè)關(guān)鍵因素。在沒(méi)有一個(gè)權(quán)威性的siRNA“基因文庫(kù)”給出經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的準(zhǔn)確序列時(shí)，至少需要設(shè)計(jì)3～5對(duì)候選序列，平行實(shí)驗(yàn)篩選出最佳靶點(diǎn)，才能確保有效、特異的沉默效能。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成4對(duì)PAX2-siRNA、并經(jīng)2'F進(jìn)行化學(xué)修飾，應(yīng)用in vivo jetPEI體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑將4對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染大鼠腎被膜下，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PAX2 mRNA抑制水平，結(jié)果4個(gè)沉默位點(diǎn)mRNA均有不同程度的抑制效果，其中PAX2-siRNA3位點(diǎn)抑制效果最明顯;應(yīng)用Western印跡法檢測(cè)PAX2蛋白抑制水平，結(jié)果顯示各位點(diǎn)蛋白均受到抑制，但PAX2-siRNA3位點(diǎn)蛋白表達(dá)量最低。結(jié)合以上結(jié)果，可充分驗(yàn)證siRNA3位點(diǎn)的設(shè)計(jì)最為理想，對(duì)PAX2干擾效果最強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)成功篩選鑒定出1對(duì)有效抑制UUO大鼠腎小管上皮細(xì)胞PAX2表達(dá)PAX2-siRNA3。為了進(jìn)一步研究PAX2蛋白在UUO中的表達(dá)及阻斷PAX2表達(dá)對(duì)UUO進(jìn)程的影響，進(jìn)而明確PAX2在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用提供新的手段。

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