王海波 蔡慎初 徐曉峰 吳式琇 黃慶科

當(dāng)前我國(guó)胃癌的防治現(xiàn)狀是“三高三低”:發(fā)病率高、病死率高、轉(zhuǎn)移率高，早期診斷率低、手術(shù)根治率低、5年生存率低?；熥鳛橹委熚赴┲匾闹委煼绞?，特別是對(duì)無法切除的胃癌病人中占主導(dǎo)地位，雖然近10年來胃癌的化療效果得到長(zhǎng)足的進(jìn)步，但至今仍無國(guó)際統(tǒng)一的“金標(biāo)準(zhǔn)”方案，與此同時(shí)，腫瘤耐藥、免疫抑制等因素使多數(shù)體質(zhì)虛弱的患者無法按期進(jìn)行化療，而中醫(yī)藥在治療胃癌上有抑瘤、調(diào)節(jié)免疫、延長(zhǎng)帶瘤生存期、提高生存質(zhì)量、減輕化療不良反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)［1～3］。

蔡氏扶正消癥湯系國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)蔡慎初教授所創(chuàng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蔡氏扶正消癥湯能有效抑制人胃癌SGC－7901細(xì)胞增殖［4］。本研究擬進(jìn)一步探討蔡氏扶正消癥湯單獨(dú)及聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)體內(nèi)外胃癌生長(zhǎng)的抑制作用，并初步探討其可能機(jī)制，為蔡氏扶正消癥湯的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)參考。

材料與方法

1.材料:奧沙利鉑(江蘇恒瑞公司);胎牛血清、RPMI－1640培養(yǎng)基和含EDTA胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和CCK－8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所);AnnexinⅤ－FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司);Bax、Bcl－2和β－actin抗體(美國(guó)Abcam公司);免疫組化SP試劑盒(北京中山金橋公司)。

2.細(xì)胞培養(yǎng):人胃癌細(xì)胞株SGC－7901購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化和細(xì)胞生物研究所。將SGC－7901細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/m l鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)液中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次，生長(zhǎng)至70%～80%培養(yǎng)瓶面積時(shí)胰蛋白酶消化傳代。

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BALB/c裸鼠40只，雄性，體重18～22g，鼠齡4～5周，溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF屏障系統(tǒng)潔凈層流架內(nèi)。

4.蔡氏扶正消癥湯水煎劑的制備:蔡氏扶正消癥湯由黃芪、人參、溫莪術(shù)、藤梨根、露蜂房、八月札、白毛根、徐長(zhǎng)卿、全蝎等藥物組成。藥材經(jīng)三蒸水漂洗3次，置燒杯中煎煮30min去渣，8層紗布過濾，60～80℃隔水蒸，濃縮成生藥1g/ml，并調(diào)節(jié)pH值7.0～7.2后4℃保存?zhèn)溆?，臨用前再以3000r/min離心5min去渣。

5.CCK－8法檢測(cè)細(xì)胞增殖:收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC－7901細(xì)胞，在96孔培養(yǎng)板每孔接種4×103個(gè)細(xì)胞，過夜貼壁后分別加入25μg/ml的奧沙利鉑、20mg/ml的蔡氏扶正消癥湯生藥及兩藥聯(lián)合作用，每組6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零組(不加細(xì)胞加入等量的PBS)。按照試劑盒說明各孔加入CCK－8溶液10μl，酶標(biāo)儀測(cè)各組A450值后計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A450值－空白調(diào)零A450值)/(對(duì)照組A450值－空白調(diào)零A450值)× 100%。

6.AnnexinⅤ－FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡:收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC－7901細(xì)胞，藥物處理同上，按試劑盒說明用500μl Binging Buffer重懸細(xì)胞，分別加入5μl AnnexinⅤ －FITC和5μl PI后混勻，室溫下避光10 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率。

7.Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中Bax和Bcl－2表達(dá):25μg/ m l的奧沙利鉑、20 mg/ml的蔡氏扶正消癥湯生藥及兩藥聯(lián)合處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC－7901細(xì)胞24h后，胰酶消化，4℃下1000r/min離心5min收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液(含50mmol/ L Tris pH 8.0，150mmol/L NaCl，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)pH 8.0，0.1%十二烷基酸鈉(SDS)，1%Triton X－100)在冰上裂解細(xì)胞30min，4℃下12000r/min離心15min，收集細(xì)胞裂解液，以Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取等量蛋白質(zhì)(30微克/孔)以12%分離膠電泳分離蛋白，5%脫脂奶4℃封閉過夜后滴加兔抗人Bax和Bcl－2抗體為第一抗體，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體，ECL顯色，X線膠片曝光。

8.人胃癌裸鼠移植瘤的建立和給藥方案:取5×106個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC－7901細(xì)胞懸浮于0.2ml無血清1640培養(yǎng)基中，注射到裸鼠腋部皮下建立人胃癌裸鼠移植瘤模型，共制備40只胃癌皮下移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、奧沙利鉑組、蔡氏扶正消癥湯組和聯(lián)合組(n=10):對(duì)照組每只裸鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.2ml;蔡氏扶正消癥湯給藥采用灌胃，劑量為10g/kg體重，相當(dāng)于人體給藥劑量的5倍，每日1次，連續(xù)使用30天;奧沙利鉑給藥采用腹腔內(nèi)注射，劑量為5mg/kg體重，隔天給藥1次，連用7次。蔡氏扶正消癥湯給藥結(jié)束后14天，處死動(dòng)物并仔細(xì)剝離腫瘤組織，稱重后計(jì)算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1－治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100%

9.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中Bax和Bcl－2表達(dá):所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛常規(guī)固定、石蠟包埋，5μm厚度連續(xù)切片。按照免疫組化SP試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色，并以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為:無陽性細(xì)胞為陰性(－)，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為弱陽性(+)，10%～50%為中度陽性(++)，＞50%為強(qiáng)陽性(+++)。Bcl－2以細(xì)胞質(zhì)或胞膜呈棕黃色顆粒為陽性，Bax蛋白以細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒為陽性。

10.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)所得計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x± s)的形式表示，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.蔡氏扶正消癥湯和奧沙利鉑對(duì)SGC－7901細(xì)胞增殖和凋亡的變化:25μg/m l的奧沙利鉑、20mg/m l的蔡氏扶正消癥湯生藥及兩藥聯(lián)合處理SGC－7901細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率分別為81.26%±10.26%、75.12%±8.95%和57.56% ±5.56%，聯(lián)合用藥組與各單藥組以及對(duì)照組相比較，均有顯著性差異(P＜0.05);蔡氏扶正消癥湯聯(lián)合奧沙利鉑作用24h誘導(dǎo)19.65%±2.08%的胃癌細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，與蔡氏扶正消癥湯單藥組12.35%±1.67%和奧沙利鉑組7.77%±1.21%以及對(duì)照組2.14%±0.56%相比較，均有顯著性差異(P＜0.05)，蔡氏扶正消癥湯組和奧沙利鉑組細(xì)胞早期凋亡率均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.蔡氏扶正消癥湯和奧沙利鉑對(duì)SGC－7901細(xì)胞中Bax和Bcl－2表達(dá)的影響:如圖1所示，與對(duì)照組相比較，奧沙利鉑和蔡氏扶正消癥湯均可上調(diào)SGC－7901細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平，聯(lián)合用藥組中Bax蛋白表達(dá)升高更明顯;而奧沙利鉑對(duì)SGC－7901細(xì)胞中Bcl－2表達(dá)無明顯抑制作用，但蔡氏扶正消癥湯單獨(dú)及聯(lián)合奧沙利鉑可顯著抑制SGC－7901細(xì)胞中Bcl－2蛋白的表達(dá)。

圖1 Western blotting檢測(cè)蔡氏扶正消癥湯和奧沙利鉑對(duì)胃癌SGC－7901細(xì)胞中Bax和Bcl－2蛋白表達(dá)的影響

3.奧沙利鉑和蔡氏扶正消癥湯對(duì)裸鼠胃癌皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用:治療結(jié)束后，各組鼠重均有不同程度的降低，對(duì)照組、奧沙利鉑組、蔡氏扶正消癥湯組和聯(lián)合用藥組裸鼠體重下降分別為0.26± 0.11g、1.1±0.34g、0.35±0.06g和0.46±0.16g，聯(lián)合用藥組裸鼠體重下降明顯低于奧沙利鉑單藥組(P＜0.05);另外奧沙利鉑組裸鼠治療期間均出現(xiàn)不同程度腹瀉和裸鼠脫水等不良反應(yīng)，但療程結(jié)束也隨之停止，而蔡氏扶正消癥湯組和聯(lián)合用藥組裸鼠的胃腸道反應(yīng)則較奧沙利鉑組明顯減輕，僅30%裸鼠出現(xiàn)少量稀便(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)第34天處死動(dòng)物，奧沙利鉑組腫瘤平均重量為0.41±0.15g，與對(duì)照組0.78 ±0.23g相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抑瘤率為47.43%;蔡氏扶正消癥湯組腫瘤平均重量為0.70± 0.21cm3，與對(duì)照組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);聯(lián)合用藥組腫瘤平均重量為0.26±0.08g，抑瘤率為66.67%，與對(duì)照組和各單藥組相比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。

4.奧沙利鉑和蔡氏扶正消癥湯對(duì)裸鼠胃癌皮下移植瘤組織中Bax和Bcl－2表達(dá)的影響:免疫組織化學(xué)染色可見對(duì)照組中大量細(xì)胞Bcl－2呈陽性表達(dá)，少數(shù)細(xì)胞Bax呈陽性表達(dá)(圖2);與對(duì)照組相比較，奧沙利鉑組中Bax蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞比率增加，而Bcl－2陽性表達(dá)無明顯影響;蔡氏扶正消癥湯組腫瘤組織中Bax和Bcl－2的表達(dá)相對(duì)對(duì)照組分別上調(diào)和下調(diào);與對(duì)照組相比較，聯(lián)合用藥組中Bcl－2陽性表達(dá)細(xì)胞顯著減少，而Bax陽性表達(dá)細(xì)胞明顯增多。

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)奧沙利鉑和蔡氏扶正消癥湯對(duì)裸鼠胃癌皮下移植瘤中Bax和Bcl－2表達(dá)的影響(×400)

討論

目前，化療是治療胃癌的主要手段之一，奧沙利鉑作為治療胃癌的一線化療藥物之一，但奧沙利鉑單獨(dú)治療胃癌的效果不理想，同時(shí)化療的不良反應(yīng)較大［2］。因此尋求一種安全有效的方法增強(qiáng)傳統(tǒng)化療藥物奧沙利鉑在胃癌中的療效受到越來越多的關(guān)注。祖國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療胃癌方面有其自身的優(yōu)點(diǎn):癥狀改善顯著，不良反應(yīng)小，全身狀態(tài)保持較好，病情發(fā)展較慢，病人腫瘤相關(guān)指標(biāo)可下降，腫瘤亦可縮小或帶瘤較長(zhǎng)期生存［3］。因此中醫(yī)藥抗腫瘤研究成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蔡氏扶正消癥湯不僅能有效抑制人胃癌SGC－7901細(xì)胞增殖，還有抑制胃癌血管生成的作用［4，5］。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)蔡氏扶正消癥湯對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC－7901有明確的增殖抑制作用，同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明蔡氏扶正消癥湯作用人胃癌SGC－7901細(xì)胞后誘導(dǎo)更多的早期凋亡細(xì)胞，從而表明蔡氏扶正消癥湯對(duì)人胃癌SGC－7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制方式可能是以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方式為主;同時(shí)本研究表明蔡氏扶正消癥湯可增強(qiáng)奧沙利鉑對(duì)體外胃癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證蔡氏扶正消癥湯單獨(dú)及聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)體內(nèi)胃癌生長(zhǎng)抑制作用，筆者建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蔡氏扶正消癥湯單獨(dú)對(duì)體內(nèi)胃癌皮下移植瘤無明顯生長(zhǎng)抑制作用，考慮到中藥抗腫瘤治療起效較慢，可能與本次體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排過短有一定關(guān)系;但蔡氏扶正消癥湯可顯著增強(qiáng)奧沙利鉑對(duì)體內(nèi)胃癌生長(zhǎng)抑制作用，表明蔡氏扶正消癥湯確切的抗體內(nèi)胃癌生長(zhǎng)的療效;同時(shí)在本次體內(nèi)實(shí)驗(yàn)期間，奧沙利鉑表現(xiàn)出一定的不良反應(yīng)，但蔡氏扶正消癥湯不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未表現(xiàn)出明顯的不良反應(yīng)，同時(shí)可削弱奧沙利鉑對(duì)瘤荷裸鼠的不良反應(yīng)，進(jìn)一步表明蔡氏扶正消癥湯在增強(qiáng)傳統(tǒng)化療藥物療效的同時(shí)，還可提高傳統(tǒng)化療藥物治療上的安全性，顯示出蔡氏扶正消癥湯應(yīng)用于胃癌治療中的可喜前景。

鑒于目前祖國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥應(yīng)用于惡性腫瘤治療中鮮有機(jī)制探討，本研究中，筆者探討了Bax/Bcl－2在蔡氏扶正消癥湯聯(lián)合奧沙利鉑在治療體內(nèi)外胃癌中的作用。在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl－2家族起到重要的雙重調(diào)節(jié)作用，凋亡抑制蛋白Bcl－2能阻止細(xì)胞通過線粒體通道途徑發(fā)生凋亡，而另一Bcl－2家族蛋白成員Bax能對(duì)抗凋亡抑制蛋白Bcl－2的作用，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［6］;最新研究表明，百里醌可通過抑制Bcl－2的表達(dá)從而增強(qiáng)奧沙利鉑對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞無明顯不良反應(yīng)［7］。在本試驗(yàn)中，蔡氏扶正消癥湯不僅能上調(diào)體外胃癌細(xì)胞中Bax表達(dá)水平，還能抑制Bcl－2的表達(dá);另外蔡氏扶正消癥湯聯(lián)合奧沙利鉑后更顯著上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl－2在胃癌細(xì)胞中的表達(dá);同時(shí)筆者在裸鼠胃癌皮下移植瘤中也觀察到類似的結(jié)果，從而表明蔡氏扶正消癥湯能調(diào)控Bcl－2家族蛋白，從而發(fā)揮抑制體內(nèi)外胃癌生長(zhǎng)的效應(yīng)。

綜上所述，在本研究首次表明，蔡氏扶正消癥湯不僅可明顯增強(qiáng)奧沙利鉑對(duì)體外胃癌的生長(zhǎng)抑制作用;同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明蔡氏扶正消癥湯應(yīng)用于胃癌治療的安全性和有效性;蔡氏扶正消癥湯單獨(dú)或聯(lián)合奧沙利鉑還可上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl－2在體外胃癌細(xì)胞以及體內(nèi)胃癌皮下移植瘤組織中的表達(dá)。因此，筆者推斷，蔡氏扶正消癥湯可靶向調(diào)節(jié)Bax和Bcl－2在胃癌中的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增強(qiáng)奧沙利鉑對(duì)體內(nèi)外胃癌的抑制作用，而蔡氏扶正消癥湯聯(lián)合奧沙利鉑有望成為新的治療方案應(yīng)用于臨床胃癌治療。

1 Jansen EP，Boot H，Dubbelman R，et al.Postoperative chemoradiotherapy in gastric cancer－a Phase I/II dose－finding study of radiotherapy with dose escalation of cisplatin and capecitabine chemotherapy［J］.Br JCancer，2007，97(6):712－716

2 王婧，田劭丹，陳信義.晚期胃癌治療進(jìn)展［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2010，37(3):171－175

3 孫大志，許玲，姜林娣，等.中醫(yī)藥治療胃癌臨床研究文獻(xiàn)質(zhì)量的調(diào)查評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2003，10(6):833－835

4 郎瑋，謝泳泳，葉人，等.扶正消癥方藥液誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2006，13(5):296－298

5 王海波，葉人，郎瑋，等.蔡氏扶正消癥湯抑制胃癌血管生成的機(jī)制研究［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，20(2):49－51

6 Su YT，Chang HL，Shyue SK，et al.Emodin induces apoptosis in human lung adenocarcinoma cells through a reactive oxygen species－dependent mitochondrial signaling pathway［J］.Biochem Pharmacol，2005，70(2):229－241

7 Banerjee S，Kaseb AO，Wang Z，et al.Antitumor activity of gemcitabine and oxaliplatin isaugmented by thymoquinone in pancreatic cancer［J］.Cancer Res，2009，69(13):5575－5583