周軍波 許麗敏 楊 曦 徐衛(wèi)峰 陳治奎 姜慶軍 胡萬英 廉姜芳 葛世俊 周建慶

已有大量證據(jù)表明血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體(lectin－like oxidized low－density lipoprotein receptor－1，LOX－1)與血管炎癥、動脈粥樣硬化斑塊形成、進(jìn)展和不穩(wěn)定有關(guān)。國內(nèi)外的多個研究均證實(shí)，LOX－1可以被氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein，oxLDL)、血管緊張素Ⅱ等多種介質(zhì)所誘導(dǎo)，并且在糖尿病、高血壓、血脂紊亂等疾病狀態(tài)中表達(dá)增加。國外已有多個對LOX－1基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病風(fēng)險的研究，但由于種族、病例數(shù)等的差別，得到的結(jié)果有較大差異，特別是針對國內(nèi)人群所開展的相關(guān)研究，目前還較少，因此開展這方面的深入研究很有必要。本研究旨在研究LOX－1基因外顯子4 G501C單核苷酸多態(tài)性與冠心病發(fā)病的相關(guān)性，初步探討遺傳因素對冠心病的影響。

材料與方法

1.對象:選擇2008年5月～2010年4月于寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院心內(nèi)科住院的患者。其中CAD患者159例為CAD組(男性116例，女性43例，平均年齡64.0±10.1歲)，所有病例均經(jīng)冠狀動脈造影證實(shí)至少一支冠狀動脈狹窄≥50%。選擇經(jīng)冠狀動脈造影排除冠心病者106例為對照組(男性49例，女性57例，平均年齡≥59.0±10.0歲)。以上受檢者均為浙東地區(qū)漢族人，排除先天性心臟病、心肌病和嚴(yán)重肝、腎疾病。

2.方法:(1)提取基因組DNA:取得患者知情同意后，于冠脈造影時抽取動脈血10m l，EDTA抗凝。常規(guī)苯酚－氯仿法抽提白細(xì)胞基因組DNA，TE溶解。紫外分光光度儀(Amersham，美國熱電)測定DNA純度與濃度后，－20℃保存。(2) PCR擴(kuò)增:采用4管 SYBR－PCR結(jié)合融解曲線方法，對G501C進(jìn)行等位基因型的檢測，具體引物序列及樣品設(shè)置參見文獻(xiàn)［1］。根據(jù)人Lox－l基因(GenBank:DQ314885)序列，利用Primer 5.0對引物進(jìn)行驗(yàn)證。引物序列由大連寶生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。每個樣品設(shè)立4個定量PCR檢測管，分別加入不同的上下游引物用于檢測健康和突變的等位基因，同時設(shè)立陽性和陰性對照。PCR反應(yīng)體系為:mix 9ml(已加入SYBR GREEN染料)，上下游引物各0.4μl，DNA模板1μl，加雙蒸水至總體積20μl(熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司)。在iCycler iQ PCR擴(kuò)增儀(BIO－RAD，美國)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。兩個位點(diǎn)PCR反應(yīng)條件均為:95℃預(yù)變性1min，然后按94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 40s進(jìn)行40個循環(huán)，終末延伸72℃ 5min。擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物以0.5℃/s做55℃到95℃的融解曲線分析。根據(jù)定量PCR儀的分析軟件獲得的Ct值和融解曲線分析結(jié)果來判定樣品的SNP類型。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀(BIO－RAD Quantity one，美國)驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性。(3)樣本測序:隨機(jī)選取50例樣本，提供引物及PCR產(chǎn)物，由南京金斯瑞生物科技有限公司測序，以驗(yàn)證熒光定量PCR檢測結(jié)果。G501C位點(diǎn)測序引物為上游: 5'－CACAAACATAACTGACTGATGAG－3'，下游:5'－TAGAGATACTACAGAGCCTGTCC－3'，PCR產(chǎn)物:356bp。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P值用CLUMP22軟件計(jì)算。各組基因型及等位基因頻率用χ2檢驗(yàn)，利用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)的方法檢驗(yàn)基因頻率是否符合Hardy Weinberg遺傳平衡定律。計(jì)量資料組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.對兩組冠心病危險因素進(jìn)行比較:結(jié)果顯示，吸煙史和高血壓史在冠心病組顯著高于對照組(P＜0.01)，而糖尿病史和冠心病家族史兩組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表1)。

2.每個樣品進(jìn)行4個平行的定量PCR反應(yīng):分別獲得陽性、陰性對照及兩種等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值和融解曲線分析結(jié)果。圖1A顯示，檢測突變型和陽性對照的PCR產(chǎn)物的Ct值一致，而檢測野生型和陰性對照的PCR產(chǎn)物的Ct值接近，融解曲線分析結(jié)果一致，DNA測序結(jié)果顯示該樣品DNA等位基因是501CC。圖1B顯示檢測野生型、突變型和陽性對照的PCR產(chǎn)物的Ct值一致，融解曲線分析結(jié)果一致，DNA測序結(jié)果顯示該樣品DNA等位基因是501GC。圖1C顯示，檢測野生型和陽性對照的PCR產(chǎn)物的Ct值接近，大約是23.7;而檢測突變型和陰性對照的PCR產(chǎn)物的Ct值接近，大約是28.2。融解曲線分析結(jié)果與Ct值一致。DNA測序結(jié)果顯示該樣品等位基因是501GG。定量PCR的基因分型結(jié)果與DNA測序結(jié)果均相符。

3.研究對象的G501C位點(diǎn)的基因型分布:經(jīng)擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)符合Hardy－Weinberg平衡，表明患者來自同一群體。

4.G501C基因多態(tài)性在CAD組及對照組中均存在G/G、G/C、C/C 3種基因型:其中G/G、G/C、C/C 3種基因型在CAD組與對照組分別占62.3%、35.8%、 1.9%和64.2%、33.0%、2.8%，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。CAD組 與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表2)。

圖1 SYBR－GREEN熒光定量PCR對LOX－1外顯子4501G＞C的基因分型及對應(yīng)的DNA測序熒光定量PCR結(jié)果和DNA測序結(jié)果相對應(yīng)，A、B、C圖依次對應(yīng)的是CC、GC、GG型

表2 CAD組與對照組G501C基因多態(tài)性基因型及等位基因頻率分布

討論

人LOX－1由273個氨基酸組成，包括胞質(zhì)內(nèi)N端，跨膜區(qū)，胞外的頸區(qū)和C型血凝素樣結(jié)構(gòu)域。多個證據(jù)支持LOX－1對動脈粥樣硬化形成起作用。Aoyama等研究了人的LOX－1基因(oxidized lowdensity lipoprotein receptor 1，OLR－1)，發(fā)現(xiàn)它是一個單拷貝基因，位于12號染色體短臂的p12.3～p13.2區(qū)域，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，共7000個堿基對。外顯子4 G501C的基因變化導(dǎo)致了K167N的錯義突變。167位氨基酸殘基位于LOX－1胞外的C－血凝素樣區(qū)域，已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)表明血凝素樣區(qū)域?qū)ε潴w的識別和結(jié)合很重要［2］。Ohmori等人檢測了586名進(jìn)行冠脈造影的患者G501C的基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，病例組CC+CG基因型頻率明顯低于正常/輕微狹窄組(36%vs 49%，P＜0.01)。按照冠心病嚴(yán)重程度分級，CC+CG基因型頻率分別為:正常/輕微狹窄(狹窄＜25%)組49%，輕度狹窄(狹窄26%～50%之間)組41%，狹窄＞50%的3個亞組中單支病變組39%，2支病變組35%，3支病變組32%，多因素分析顯示CC+CG基因型頻率與狹窄嚴(yán)重度呈負(fù)相關(guān)(OR=0.61;95%CI:0.41～0.92)［3］。但在本研究中，G501C基因位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在冠心病組和對照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Elisabetta Trabetti、Sentinelli等人的研究結(jié)果相符［4，5］。不同的研究得出的結(jié)果不同，可能與種族差異、病例數(shù)不同有關(guān)。

CAD的發(fā)病存在著遺傳異質(zhì)性并且受環(huán)境因素的影響，不同的基因突變均可能導(dǎo)致CAD，但不同的基因突變引起的臨床表型可能不同，如性別差異、CAD中存在的某些特殊的病理或生物學(xué)特征即中間表型(這些中間表型能反映其發(fā)展早期或中期病理變化的一系列生化或生理性狀)、發(fā)病年齡和疾病的嚴(yán)重程度等，從而可導(dǎo)致易感基因研究結(jié)果的不一致。在多基因疾病中，僅僅一個易感基因并不意味著高風(fēng)險。事實(shí)上，大多數(shù)的攜帶者雖然存在著某些生物學(xué)缺陷即中間表型，但并不表現(xiàn)任何的臨床癥狀。

經(jīng)過搜索PUBMED，EMbase，SpringLink等數(shù)據(jù)庫，以及參考一些研究的文獻(xiàn)，將一些研究成果與本研究的結(jié)果進(jìn)行比較，表3列舉了G501C基因多態(tài)性與CAD相關(guān)性的部分研究。從2003年至今選取了10份病例－對照組的研究與本研究的結(jié)果進(jìn)行分析比較，總共分析了5679個病例和15511個對照的情況。

表3和表4分別呈現(xiàn)了顯性模式和隱性模式下G501C基因多態(tài)性和CAD的關(guān)聯(lián)性。在顯性模式下，7個研究(1，3，6，8～11)顯示突變降低了CAD的風(fēng)險，3個已有研究(4，7，9)和本研究顯示突變能增加CAD的風(fēng)險。在隱性模式下，7個已有研究(3，4，6，8～10)和本研究顯示突變降低了CAD的風(fēng)險，而3個研究(1，7，11)顯示突變能增加CAD的風(fēng)險。經(jīng)過薈萃分析，不管是在顯性模式還是隱性模式中，G501C與CAD都沒有顯著的關(guān)聯(lián)性。

表3 在薈萃分析(顯性模式)中G501C和CAD的關(guān)系

表4 在薈萃分析(隱性模式)中G501C和CAD的關(guān)系

可以發(fā)現(xiàn)，不同時期和不同國家的研究結(jié)果差異很大，這可能跟病例數(shù)較少以及種族之間的差異有很大的關(guān)聯(lián)性，因此開展這方面的深入研究非常必要。本研究的總病例數(shù)僅265例，如能開展更大規(guī)模的研究，應(yīng)可以得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。總之，本研究顯示LOX－1基因G501C位點(diǎn)的基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病無顯著關(guān)聯(lián)。

1 單志新，符永恒，周志凌，等.Lox－1基因501G＞C和3'UTR188C＞T多態(tài)性與急性心肌梗死發(fā)病的相關(guān)性［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2007，7(11):1048－1051

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5 Sentinelli F，F(xiàn)ilippi E，F(xiàn)allarino M，et al.The 3'UTR C＞T polymorphism of the oxidized LDL－receptor1(OLR1)gene does notassociate with coronary artery disease in Italian CAD patientsorwith the severity of coronary disease［J］.Nutr Metab Cardiovasc Dis，2006，16:345－352

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