楊明峰 李志國 孫紅崗 董學(xué)君

NF－κB作為調(diào)節(jié)多種蛋白轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起十分重要的作用［1，2］。目前有不少的國內(nèi)外文獻(xiàn)報道NF－κB p65 mRNA在癌組織中高表達(dá)，且與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)［3，4］;但NF－κB p65血清蛋白表達(dá)是否與組織mRNA表達(dá)一致，血清表達(dá)與病理特征有何關(guān)系，結(jié)果尚不一致。本文用ELISA法、RT－PCR法和Western blotting法檢測乳腺癌患者血清NF－κB p65、組織NF－κB p65 mRNA及NF－κB p65蛋白的表達(dá)，分析組織和血清中的表達(dá)是否一致，血清學(xué)檢測與臨床病理特征有何關(guān)系，評價血清NF－κB p65在乳腺癌診斷和治療中的應(yīng)用價值。

材料與方法

1.材料:收集筆者醫(yī)院2009年6～9月41例乳腺癌手術(shù)組織(病理診斷明確，術(shù)前未做過放療和化療)，癌旁組織和15例乳腺良性腫塊組織為對照組(經(jīng)HE染色觀察圖1)。收集上述乳腺癌患者血清，另收集39例乳腺癌患者血清，60例乳腺良性腫塊和正常人血清為對照組。收集的組織和血清標(biāo)本經(jīng)分裝后分別保存于液氮和－80℃冰箱。80例患者均為女性，年齡31～77歲，病理類型見表2。NF－κB p65 ELISA試劑盒(美國RD公司)，Trizol總RNA提取液(上海閃晶分子生物技術(shù)研究所)，Takara primeScriptTMRT－PCR Kit(大連寶生物工程有限公司)，PARISTM Kit(美國AMBION公司)，兔抗人NF－κB p65多抗(MILLIPORE公司)、兔抗人β－actin多抗(SANTA CRUZ公司)HRP－羊抗兔的IgG(SANTA CRUZ公司)，Bradford檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

2.免疫組織化學(xué)方法及陽性結(jié)果判定:石蠟標(biāo)本4μm厚連續(xù)切片，脫蠟，采用高溫、高壓修復(fù)抗原，組化染色按SP試劑盒說明書進(jìn)行。用PBS液代替一抗作為空白對照。ER、PR、Her－2均以細(xì)胞核和(或)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞＜15%為－，15%～25%為+，25%～45%為++，＞45%為+++。背景無顏色或淡黃色。

3.組織NF－κB p65 mRNA的RT－PCR檢測:乳腺癌、癌旁、乳腺良性腫瘤組織中總RNA的提取參照Trizol使用說明書?？俁NA 1μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件:30℃10min，42℃30min，95℃ 5min。PCR擴增NF－κB p65/β－actin mRNA，引物由上海生工生物工程(上海)有限公司合成，序列如下:①NF－κB p65:上游引物5'－TGCCGAGTGAACCGAAAC－3'，下游引物5'－TGCCCAGAAGGAAACACC－3'，目的片段長度為527bp;②β－actin:上游引物5'－TTCCTTCTTGGGTATGGAAT－3'，下游引物5'－GAGCAATGATCTTGATCTTC－3'，目的片段長度為200bp。擴增條件:95℃3min預(yù)變性，94℃30s，60℃30s，72℃1min，35個循環(huán);72℃ 7min延伸。陽性對照為乳腺癌細(xì)胞株MCF－7，用蒸餾水作為陰性對照。取5μl PCR擴增產(chǎn)物與1μl6×Loading buffer液混合均勻后進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠(溴化乙錠10mg/ml)電泳，計算機掃描成像判斷結(jié)果。結(jié)果判斷:樣本瓊脂糖電泳照片采用Quantity one分析軟件進(jìn)行灰度掃描，測定待測樣本和內(nèi)參β－actin的積分光密度(IA)。樣本量的數(shù)值以目的片段IA/β－actin的IA的比值來表示。以乳腺癌(良性腫瘤)病灶組織的積分光密度比值/對應(yīng)灶旁正常組織的積分光密度比值＞1.5為陽性，＞1.5以“+”表示，＞2以“++”表示。

4.組織NF－κB p65蛋白Western blotting檢測:乳腺癌、癌旁、乳腺良性腫瘤組織中蛋白質(zhì)樣品的制備參照PARISTM Kit使用說明書。采用Bradford法檢測蛋白提取液的濃度。蛋白提取液與上樣緩沖液按3∶1混勻，100℃變性5min，上樣至12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳2.5h;濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;用含2%BSA的PBST封閉1.5h;用含兔抗人NF－κB p65多抗(1∶500)、兔抗人β－actin多抗(1∶500)一抗孵育液4℃過夜，PBST漂洗，HRP－羊抗兔的IgG(1∶300)室溫孵育2h，PBST、PBS漂洗后用ECL發(fā)光試劑在暗室壓片顯色。結(jié)果判斷:膠片經(jīng)掃描后，采用Quantity one分析軟件進(jìn)行灰度掃描，具體方法類同于RT－PCR檢測的積分光密度比值＞1.5為陽性(+)。

5.血清NF－κB p65的ELISA檢測:操作方法見試劑盒說明。濃度＞40ng/ml為陽性，＞40ng/m l為(+);＞80ng/ml為(++)。

6.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，采用t檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗，Kappa一致性檢驗及Spearman秩相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.組織HE染色結(jié)果:顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，41例癌組織標(biāo)本癌細(xì)胞均占70%以上，而癌旁組織中無癌細(xì)胞浸潤(圖1)。

圖1 乳腺癌及癌旁組織HE染色(HE，×200)

2.乳腺癌組織NF－κB p65的表達(dá)結(jié)果:41例乳腺癌組織中NF－κB p65 mRNA和蛋白積光密度比值＞1.5的分別為87.9%和82.9% 。乳腺癌組織NF－κB p65 mRNA的RT－PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果表明乳腺癌組織NF－κB p65 mRNA的表達(dá)較對應(yīng)癌旁組織及乳腺良性腫塊組織明顯增加(圖2)。組織Western blotting結(jié)果與RT－PCR結(jié)果相似，乳腺癌組織NF－κB p65蛋白表達(dá)較對應(yīng)癌旁組織及乳腺良性腫塊組織明顯增加(圖3)。

3.血清NF－κB p65的表達(dá)及其與組織NF－κB p65表達(dá)的關(guān)系:乳腺癌患者血清中NF－κB p65的含量(46.4±26.13ng/ml)明顯高于對照組(22± 16.5ng/ml)，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。血清NF－κB p65與組織NF－κB p65表達(dá)同為“+”的23例，同為“++”的4例，同為“－”的3例。采用Kappa一致性檢驗，Kappa=0.458，95%可信區(qū)間(0.319，0.630)，可以認(rèn)為具有一致性。采用相關(guān)(P＜0.05)，Spearman秩相關(guān)分析，rs=0.369，P＜0.05，表達(dá)一致率為73.2%(表1)。

表1 血清與組織中NF－κB p65表達(dá)的相關(guān)性

4.血清NF－κB p65與患者臨床病理特征之間的關(guān)系:80例乳腺癌患者血清NF－κB p65陽性率為80%，對照組為13.3%(表2)。不同年齡段、TNM分期和ER、PR表達(dá)情況的血清NF－κB p65表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。而不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度及Her－2表達(dá)狀況的血清NF－κB p65表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 血清NF－κB p65表達(dá)與乳腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

討論

NF－κB是具有多種生物活性的轉(zhuǎn)錄因子，正常細(xì)胞中NF－κB主要存在于胞質(zhì)，與IκB結(jié)合，形成無活性的三聚體。當(dāng)細(xì)胞受刺激時，NF－κB主要通過p65亞基在細(xì)胞核中調(diào)控多種基因的表達(dá)，在腫瘤形成和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［5］。本研究結(jié)果表明，與對照組比(含良性腫塊)，NF－κB p65 mRNA和蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)均明顯升高，與文獻(xiàn)報道的一致［6，7］。由于大部分腫瘤相關(guān)抗原可分泌入血液，血清學(xué)檢測簡單快速，且血清標(biāo)本可在未手術(shù)時取得，減小對患者的創(chuàng)傷性。本研究檢測了血清NF－κB p65濃度，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者NF－κB p65表達(dá)明顯高于對照組，而且Kappa一致性檢驗結(jié)果表明乳腺癌患者NF－κB p65血清表達(dá)與組織表達(dá)具有一致性，提示檢測血清NF－κB p65濃度可部分反應(yīng)組織NF－κB的活性，對診斷惡性乳腺癌具有一定的價值。我們采用HE染色法對收集的標(biāo)本進(jìn)行選擇，癌組織中癌細(xì)胞率在70%以上，而癌旁組織則無癌細(xì)胞浸潤，降低了實驗取材誤差，然而我們還是發(fā)現(xiàn)癌旁組織NF－κB p65有一定程度的表達(dá);同時Kappa系數(shù)一般要＞0.7時，才表明吻合度好，所以血清檢測不能完全取代組織NF－κB p65檢測，這與癌旁炎癥細(xì)胞表達(dá)NF－κB p65是否有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

目前多數(shù)國內(nèi)外的研究表明，乳腺癌組織NF－κB p65的表達(dá)與乳腺癌的轉(zhuǎn)移及Her－2高表達(dá)相關(guān)，本研究結(jié)果進(jìn)一步表明乳腺癌患者血清NF－κB p65的表達(dá)與乳腺癌的轉(zhuǎn)移及Her－2高表達(dá)相關(guān)，而這兩個臨床病理特征代表著乳腺癌的惡性程度，因此血清NF－κB p65檢測可能是評判乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)之一。文獻(xiàn)報道癌細(xì)胞NF－κB的表達(dá)與雌激素受體表達(dá)之間不一致，Jones等［6］認(rèn)為NF－κB p65與ER、PR表達(dá)負(fù)相關(guān)，而Frasor等認(rèn)為ER陽性時能增加NF－κB的活性，我們的研究表明血清NF－κB p65的表達(dá)與雌激素受體表達(dá)的相關(guān)性尚無統(tǒng)計學(xué)意義，因此我們認(rèn)為血清NF－κB p65尚不能作為雌激素受體表達(dá)情況的預(yù)判指標(biāo)。

總之，乳腺癌患者血清NF－κB p65濃度與對照組相比明顯升高，且血清濃度能部分反應(yīng)組織NF－κB p65的表達(dá)。同時血清學(xué)指標(biāo)與臨床病理特征關(guān)系的分析表明，血清NF－κB p65表達(dá)檢測對預(yù)測乳腺癌轉(zhuǎn)移與否和選擇治療方案也有一定的價值。

1 Vonach C，Viola K，Giessrigl B，et al.NF－κB mediates the 12(S)－HETE－induced endothelial to mesenchymal transition of lymphendothelial cells during the intravasation of breast carcinoma cells［J］.Br JCancer，2011，105(2):263－271

2 Liu M，Sakamaki T，Casimiro MC，et al.The canonical NF－kappaB pathway governsmammary tumorigenesis in transgenic mice and tumor stem cell expansion［J］.Cancer Res，2010，70(24):10464－10473

3 Bhaumik D，Scott GK，Schokrpur S，et al.Expression ofmicroRNA－146 suppresses NF－κB activity with reduction ofmetastatic potential in breast cancer cellsSuppression of NF－κB activity in cancer cells by miR－146［J］.Oncogene，2008，27(42):5643－5647

4 童仕倫，李恒平，魏文.胃癌組織中核轉(zhuǎn)錄因子－κB表達(dá)與意義［J］.中華實驗外科雜志，2006，7(23):873－874

5 周潔，陳虎，鄭海，等.Celecoxib可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子－κB活性誘導(dǎo)SGC7901/ADR細(xì)胞的凋亡［J］.中華實驗外科雜志，2010，9(27):1269－1271

6 Jones RL，Rojo F，A'Hern R，et al.Nuclear NF－κB/p65 expression and response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer［J］.JClin Pathol，2011，64(2):130－135