馮安林，涂鎮(zhèn)波，張增峰，樊曉暉

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，廣西南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，廣西南寧530021）

A型流感病毒屬于正黏病毒科，有8個片段的反義RNA鏈，編碼11個蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白和一些非結(jié)構(gòu)蛋白。流感病毒膜表面有2種重要的糖蛋白，即血凝素（hamegglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）蛋白，包括16種HA亞型和9種NA亞型［1］，任何一種HA和NA均可組成一種血清型。水禽類是所有16種HA亞型的A型流感病毒宿主，而人一般是H1、H2和H3亞型的流感病毒的宿主［2］。

進(jìn)入20世紀(jì)以來，曾出現(xiàn)過幾次大的流感部分暴發(fā)，比如1918年的西班牙流感、1957年的亞洲流感和1968年的香港流感［3］，被認(rèn)為來源于禽類的流感病毒［2］。為什么會發(fā)生這種禽流感病毒跨種屬傳播到人，流感病毒又是依靠什么變異來突破這種屏障？隨著目前關(guān)于流感病毒科研的進(jìn)展，人們對流感病毒這類跨種屬傳播所需具備的分子變化基礎(chǔ)也越來越清楚。

1 HA蛋白和唾液酸受體的結(jié)合特性

HA蛋白是A型流感病毒膜上的一個重要的糖蛋白，在病毒感染的初始階段，它負(fù)責(zé)與宿主呼吸道或消化道上皮細(xì)胞膜末端帶唾液酸的糖鏈結(jié)合［4］，是A型流感病毒接觸和進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵。表觀上的結(jié)構(gòu)顯示，HA在毒粒表面呈柱狀刺突，由一個纖維狀桿部和3個球狀頂部組成，3個頂端各有一個“淺袋狀”結(jié)構(gòu)，這個淺袋狀結(jié)構(gòu)正好可以裝入宿主細(xì)胞膜上糖鏈末端的唾液酸分子［5］。HA上的三個球狀頂部是三聚體結(jié)構(gòu)，每一個單體都是以多肽鏈HA0的前體形式合成，而HA0可被宿主細(xì)胞內(nèi)的胰蛋白酶分解成HA1和HA2兩個亞單位，球部主要是HA1單位，桿部主要由HA2和HA1的N、C末端組成，其中作為受體結(jié)合部位（receptor binding domain，RBD）的淺袋狀結(jié)構(gòu)位于HA1亞單位上，一般來說，位于RBD周圍的氨基酸殘基相對其它部位更易變異，而桿部的氨基酸則相對保守［6］。

唾液酸（sialic acid，SA），全稱 N－乙酰神經(jīng)氨酸，為一種單糖，細(xì)胞高爾基體內(nèi)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移一分子的唾液酸至新的糖基受體，而流感病毒可以識別并結(jié)合這些細(xì)胞膜上的糖鏈［7］。唾液酸α2－3半 乳 糖 （SAα2－3Galβ）和 唾 液 酸 α2－6 半 乳 糖（SAα2－6Galβ）均以 C連接方式最常見，一般來說，人流感病毒結(jié)合在SAα2－6Galβ糖鏈上，而禽類流感病毒主要結(jié)合在SAα2－3Galβ糖鏈的受體上，所以如果發(fā)生一個種屬到另一個種屬的傳播只會優(yōu)先出現(xiàn)在這個種屬的宿主兼有這兩種受體分布的情況下［8］，有趣的是，豬流感病毒能同時結(jié)合在兩種受體上，或主要結(jié)合在 SAα2－6Galβ序列的受體上［9］，正是這種流感病毒結(jié)合偏好的不同導(dǎo)致了異種間直接傳播的障礙。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SAα2－6Galβ受體具有兩種構(gòu)象，Chandrasekaran A 等［10］用激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，上呼吸道纖毛細(xì)胞具有很多長鏈結(jié)構(gòu)的SAα2－6Galβ，可以根據(jù)結(jié)構(gòu)分型出兩種拓?fù)錁?gòu)型即圓錐和傘形。SAα2－3Galβ和短鏈的SAα2－6Galβ呈圓錐形，而長鏈的 SAα2－6Galβ呈傘形，后者擴大了與血凝素RBD的結(jié)合。隨后的數(shù)據(jù)分析表明H1N1和H3N2可與傘形糖鏈結(jié)合，而H5N1只能結(jié)合圓錐形糖鏈，即便是最近變異的H5N1具有了與短鏈SAα2－6Galβ的結(jié)合，仍不能有效感染上呼吸道纖毛上皮，以致很難實現(xiàn)人與人之間傳播。

2 流感病毒的基因重配作用

其他種類的流感病毒要想適應(yīng)性改變獲得感染人的能力，必須通過基因突變（抗原漂移）或基因重配（抗原轉(zhuǎn)變），前者是病毒在宿主體內(nèi)的適應(yīng)性改變，而后者則是一個宿主細(xì)胞內(nèi)感染了多種流感病毒，發(fā)生病毒基因片段的重配產(chǎn)生新的毒株［11］。自然界中有些動物可以同時感染人流感和禽流感病毒，它們被稱之為中間宿主，豬最先被認(rèn)為是中間宿主。Ito T等［12］用凝集素結(jié)合試驗來觀察鴨結(jié)腸和豬氣管的唾液酸受體的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鴨結(jié)腸對 MAA（特異性結(jié)合SAα2－3Galβ）凝集素呈強結(jié)合特性，幾乎不結(jié)合SNA（特異性結(jié)合SAα2－6Galβ）凝集素，而豬氣管對這兩種凝集素都有結(jié)合，提示豬能同時結(jié)合禽類和人流感病毒。這兩種病毒都可在豬上皮細(xì)胞同時復(fù)制增殖，其可能原因為基因片段的重配，使得禽流感病毒選擇性地獲得人流感病毒相類似的結(jié)合特性，Hass J等［13］比對了469株分離自人、鳥和豬的H1N1亞型流感病毒的基因信息，并建立了進(jìn)化樹，同時在貝葉斯概率框架里推斷出大部分跨種屬傳播的H1亞型流感病毒來源于豬，所以豬可以被看成制造基因重組流感病毒的“混合容器”［2］。事實上，通過基因比對和進(jìn)化分析表明，2009年暴發(fā)的H1N1亞型流感病毒是一個三重排的A型流感病毒，來自禽類、豬和人的流感病毒在豬體內(nèi)的重新整合，進(jìn)一步驗證了豬是“基因混合器”的這一說法［14］。

同樣，確定人體內(nèi)的唾液酸受體分布對了解流感病毒的結(jié)合感染起著至關(guān)重要的作用。Zhang Z F等［15］通過類似的凝集素結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)人上呼吸道，如氣管和支氣管多為SAα2－6Galβ受體分布，而SAα2－3Galβ受體只有零星分布，但是在細(xì)支氣管和氣泡里SAα2－3Galβ受體明顯增多。隨后用 H5N1亞型禽流感病毒和人H3N2亞型流感病毒去感染各個截斷的組織切片進(jìn)行體外感染試驗，發(fā)現(xiàn)其病毒結(jié)合部位與唾液酸分布特點基本吻合。這些試驗結(jié)果一方面說明了禽流感病毒不易導(dǎo)致人感染的原因，另一方面又提示大劑量的禽流感病毒導(dǎo)致人感染，可能是通過結(jié)合了下呼吸道上的SAα2－3Galβ受體［16］。

但是，從1997年和1999年在香港暴發(fā)的禽流感H5N1和H9N2卻是直接從禽類感染人，從那以后，整個亞洲對檢測禽類體內(nèi)的高致病性禽流感病毒的監(jiān)督力度開始加大［17］，Duan L等［18］根據(jù)從家禽體內(nèi)分離到的318株H5N1亞型流感病毒的全基因組信息，得到了44種不同的重組體，它們的HA和NA基因都來自一株 A／Goose／Guangdong／1／1996的H5N1亞型流感病毒，推測家禽也可能起著基因整合的作用。Yu J E等［19］的試驗表明除水禽類鴨只有少量分布的SAα2－6Galβ受體外，陸禽類的雞、鵪鶉和野雞的呼吸道均表達(dá)較多的SAα2－6Galβ以及SAα2－3Galβ受體，這些常見的陸地禽類動物在重組流感病毒基因片段中起著一定作用，使得中間宿主這一概念得到進(jìn)一步的拓寬。

3 流感病毒自身的基因突變

流感病毒可以通過基因重組或基因突變兩種形式來適應(yīng)性的結(jié)合在人呼吸道上皮細(xì)胞上，而后者可以通過特定氨基酸的改變引起病毒結(jié)合特性的改變，明晰這種變化對理解病毒結(jié)合特異性改變的原理和相關(guān)的預(yù)防監(jiān)測都十分重要。Connor R等［20］用56株來自禽類、馬和人體內(nèi)分離到的H2、H3型流感病毒做唾液酸多糖鏈結(jié)合特異性的測定，結(jié)果表明具有人結(jié)合特性，即能結(jié)合到SAα2－6Galβ糖鏈上的血凝素的氨基酸殘基226和228位分別是Leu和Ser，而來自禽類和馬的226位和228位分別是Gln和Gly，這種L226Q和S228G變換了的病毒幾乎只結(jié)合SAα2－3Galβ糖鏈，只有很微弱的人結(jié)合特性，這種氨基酸殘基的雙重差異徹底改變了H2和H3亞型流感病毒血凝素的結(jié)合特異性。事實上，H2血清型流感病毒的HA晶體結(jié)構(gòu)表明，它的RBD周圍環(huán)繞著4個二級結(jié)構(gòu)，即190螺旋（殘基190到 198）、220環(huán) （221 到 228）、130 環(huán) （134 到138）和一個155位的Thr，以及一些保守的芳香族氨基酸殘基，如98位的Tyr和153位的Trp等圍成［21］。Leu226的側(cè)鏈?zhǔn)杷ε懦庵鳷yr98的苯環(huán)，同時Ser226與Tyr98上的羥基之間的范德瓦爾斯力促使Tyr98離開環(huán)220一定距離，延長了H2病毒HA的RBD區(qū)域。人上呼吸道長鏈傘形構(gòu)象的SAα2－3Galβ更易于和在226，228位點替換了的病毒結(jié)合，突變造成了能在人與人之間傳播的流感病毒。相類似的序列差異也出現(xiàn)在H3亞型禽流感病毒和H3亞型人流感病毒中，主要是人細(xì)胞受體上的Gal單位與HA上Leu226的疏水作用為H3亞型流感病毒提供了適度的結(jié)合親和力［22］，病毒通過這2個位點的突變能有效地適應(yīng)性感染人。

H1病毒也可以發(fā)生相類似的變異，Matrosovich M等［23］利用反向遺傳學(xué)技術(shù)置換了一株在家畜流行的H1N1亞型禽流感病毒HA上的特定氨基酸殘 基，通 過 Glu190Asp（E190D），Gly225Glu（G225E）的置換使病毒與唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)特性從SAα2－3變?yōu)镾Aα2－6。到目前為止，只有 H1、H2和H3這3種流感病毒亞型可以通過2個位點的突變完全改變結(jié)合特性，這種發(fā)現(xiàn)更深入理解了流感病毒的跨種屬傳播所具備的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

H5N1亞型流感病毒屬于高致病性禽流感，因為它的高死亡率，所以需監(jiān)測防止其大規(guī)模感染人。Stevens J等［6］觀察 H5N1病毒共晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)具有類似的190螺旋、130和220環(huán)，以及保守的芳香族氨基酸，但是做同樣的類似H1的E190D、G225E變換或類似H2，H3的Q226L、G228S變換卻不能觀測到相類似的結(jié)合特異性的改變，只能降低SAα2－3的結(jié)合能力，卻沒能顯著增加SAα2－6的結(jié)合。Yang Z Y等［24］用S137A和T192I的置換同時改變了H5病毒HA的130環(huán)和190螺旋，發(fā)現(xiàn)能夠增加對SAα2－6的結(jié)合能力，但未能等同于上面H1和H3病毒類似的改變，可能是因為其結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，不能單純地依靠改變RBD周圍的氨基酸而產(chǎn)生作用。其它種類的禽類流感病毒還未發(fā)現(xiàn)這種依靠堿基適應(yīng)性變異成人流感病毒的例子，但是這種增加與人結(jié)合能力的突變?nèi)灾档藐P(guān)注和監(jiān)測。

4 抗原性的改變

流感病毒的抗原性隨著變異而改變，它的抗原位點變異主要集中在RBD周圍的區(qū)域，相對于這個區(qū)域，球狀頭部以下的桿狀部分多為保守的氨基酸，其為介導(dǎo)細(xì)胞融合的關(guān)鍵。但是，機體免疫系統(tǒng)通常把目標(biāo)定位在多變的頭部，因此只能中和免疫的病毒和相近的毒株，如何讓宿主免疫集中應(yīng)答在這些保守的抗原表位上，成了制造更廣泛有效流感疫苗的主要障礙［21］。

HA上的糖修飾影響著機體對病毒的免疫結(jié)合，例如從2004年－2005年里分離到的H5N1里都有變異Ala160Thr（A160T），其引入了一個新的N－糖基化位點Asn158，這個新引入的糖鏈對HA上的一個抗原表位產(chǎn)生位阻效應(yīng)［6］，使宿主不能有效地對這些病毒進(jìn)行識別和免疫攻擊，對病毒起著掩蓋的作用。Wang C C等［25］通過縮減 HA上的所有糖基化位點，使只剩下最后一個N－乙酰葡萄胺，發(fā)現(xiàn)它的結(jié)合特異性減小，但卻增加了SAα2－3的結(jié)合力，可能是HA上的糖鏈的位阻效應(yīng)產(chǎn)生了受體結(jié)合特異性，這種相對非特異性的病毒容易結(jié)合到人肺部的其他形式的多糖上，雖然加劇了受感染的危險，消失的糖鏈卻暴露了HA桿部的保守序列，可以引起針對它的更強烈的免疫反應(yīng)，這可以為制造更有效且廣泛的病毒疫苗提供新的方法。

5 小結(jié)

近年年，禽類流感病毒跨種屬傳播到人的事件越顯頻繁，而隱藏在下面的分子機制則十分復(fù)雜，目前的研究主要集中在HA和宿主表皮的唾液酸受體的結(jié)合特異性上。通過凝集素組化和分子進(jìn)化樹的方法，發(fā)現(xiàn)了越來越多的可以同時感染人流感和禽流感病毒的中間宿主，它們起著“基因混合器”的作用，其具有產(chǎn)生適應(yīng)性感染人的重組病毒的潛在威脅。而另一種威脅則來自病毒自身的基因突變，如H1、H2和H3血清型的禽流感病毒均可通過在RBD周圍兩個氨基酸的突變來適應(yīng)性感染人，雖然這種變換形式在H5N1亞型等其他禽流感病毒中尚未發(fā)現(xiàn)，但是類似的增加SAα2－6結(jié)合能力的突變還是值得關(guān)注和監(jiān)測。HA的變異同樣可以引起流感病毒抗原性的改變，主要是由自身的糖修飾的改變所引起的，而根據(jù)這種變異的特性可以為制造更廣泛有效的流感疫苗提供一個方向。但是，關(guān)于流感病毒結(jié)合特性仍有諸多問題尚未明了，比如H5N1亞型流感病毒能不能完全適應(yīng)人，需要怎樣的分子置換，還需進(jìn)一步的研究。

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