吳世卿 曾曙光 溫志欣 彭細毛 李玉蘭 卿安蓉

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院·順德第一人民醫(yī)院 口腔科，順德528300；2.廣東省口腔醫(yī)院 口腔頜面外科，廣州510280）

酪氨酸激酶受體2（tyrosine kinase 2 with immunoglobulin-like and epidermal growth factor homology domains，Tie2）是表達于血管內(nèi)皮細胞的血管生長調(diào)節(jié)因子，與腫瘤的微血管及生物學(xué)行為密切相關(guān)。人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）具有分化潛能和新生血管內(nèi)皮細胞的特異性。本研究采用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，將攜帶有Tie2基因的特異性短發(fā)夾狀RNA（short hairpin RNA，shRNA）片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HUVECs中，然后用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real time quantitation reverse transcriptase polymerase chain reaction，QRT-PCR）和免疫印跡（Western blot）法分別檢測細胞中Tie2 mRNA和蛋白表達的改變情況，探討沉默Tie2基因是否會對HUVECs的生長起調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

HUVECs：第4～6代，由廣東省口腔醫(yī)院實驗室保存。含有特異性針對Tie2的shRNA的pGenesil-1質(zhì)粒（pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA），由武漢晶賽公司設(shè)計合成，經(jīng)預(yù)試驗選用Tie2目的基因序列為5’-GATGCGTCAACAAGCTTCC-3’；以HUVECs里不具備的基因hk為陰性對照，其基因序列為5’-GACTTCATAAGGCGCATGC-3’。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組和培養(yǎng) 細胞分為3組：實驗組為pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA質(zhì)粒＋LipofectamineTM2000脂質(zhì)體，陰性對照組為pGenesil-hk質(zhì)粒＋LipofectamineTM2000脂質(zhì)體，空白對照組為無轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染前1 d，將HUVECs按每孔1×105個細胞接種于六孔板中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染當(dāng)日用OPTI-MEM Ⅰ培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美國）稀釋LipofectamineTM2000脂質(zhì)體（Invitrogen公司，美國）和質(zhì)粒（同一培養(yǎng)基中加入0.5 μL脂質(zhì)體和1 μg質(zhì)粒），轉(zhuǎn)染HUVECs，具體操作按LipofectamineTM2000說明書進行。熒光顯微鏡下觀察各組細胞的轉(zhuǎn)染情況，并計算轉(zhuǎn)染率。

1.2.2 QRT-PCR檢測HUVECs中Tie2 mRNA的表達在Genbank中查找Tie2的序列（NM_000459.3），采用Olig5軟件設(shè)計PCR引物。Tie2上游引物為：5’-TCCAAGGATGTCTCTGCTCTC-3’，下游引物為：5’-TTGGGGTCATCCTCGGTAT-3’；內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物為：5’-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3’，下游引物為：5’-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3’。

將細胞分別按實驗組、陰性對照組和空白對照組接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，分別在轉(zhuǎn)染后24、48 h提取細胞總RNA（Invitrogen公司，美國），電泳檢測RNA的完整性，紫外分光光度計檢測RNA的質(zhì)量濃度和純度；QRT-PCR（GeneCopoeia公司，美國）檢測Tie2 mRNA的表達。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃10 min；變性95 ℃10 s，退火60 ℃20 s，延伸72 ℃15 s，40個循環(huán)；終末循環(huán)延伸72 ℃8 min。上述實驗操作重復(fù)3次。Tie2的mRNA相對表達量經(jīng)內(nèi)參照GAPDH校正，參照Livak等[1]報道的方法分析結(jié)果。

1.2.3 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后HUVECs中Tie2蛋白的變化情況 細胞轉(zhuǎn)染和分組同1.2.2。分別于轉(zhuǎn)染后24、48 h提取各組細胞的蛋白，采用Western blot法檢測Tie2的蛋白表達情況，按照說明書測定蛋白的相對表達量。各組所用的Tie2抗體和細胞骨架蛋白αtuburlin抗體均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。實驗操作重復(fù)4次。各組細胞的Tie2蛋白、α-tuburlin蛋白的Western blot結(jié)果由數(shù)碼相機拍攝成像，并用Image J軟件分析各顯影帶的灰度值。

1.2.4 轉(zhuǎn)染后HUVECs凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 細胞轉(zhuǎn)染和分組同1.2.2。分別于轉(zhuǎn)染后24、48 h收集細胞涂片。每張涂片用蘇木素染色10 min，自來水沖洗去除殘留的染色液；用含1%鹽酸的70%乙醇溶液進行分色，脫去多余的染料，自來水沖洗15 min使之藍化；放入1%伊紅水溶液中浸染10 min；蒸餾水洗去載玻片上的染液，脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，分別選擇細胞密度均一的5個高倍視野，計算總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)（以細胞核染色質(zhì)出現(xiàn)明顯的邊緣化凝集為凋亡細胞的標(biāo)志）。

1.2.5 噻唑藍比色分析（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞的增殖情況 以每孔2×104個細胞接種到96孔板，分別在轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后1、2、3、4 d用MTT溶液顯色，孵育，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，置于酶標(biāo)儀上測定各孔的吸光度A值，測定波長為490 nm。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制細胞的生長曲線圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 pGenesil-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況

pGenesil-1質(zhì)粒有效轉(zhuǎn)染入HUVECs中，各組細胞的轉(zhuǎn)染情況見圖1：實驗組和陰性對照組均有綠色熒光表達，而空白對照組無綠色熒光表達，提示轉(zhuǎn)染成功。重復(fù)轉(zhuǎn)染4次，轉(zhuǎn)染率均為65%左右。

2.2 QRT-PCR檢測結(jié)果

各組細胞的QRT-PCR結(jié)果見表1。與陰性對照組和空白對照組相比較，實驗組轉(zhuǎn)染24、48 h后細胞中的Tie2 mRNA相對表達量均下調(diào)，轉(zhuǎn)染48 h后下調(diào)更為明顯。

圖1 轉(zhuǎn)染的pGenesil-1質(zhì)粒表達綠色熒光蛋白 熒光顯微鏡×100Fig 1 Cells successfully transfected with the pGenesil-1 plasmid expressed green fluorescent protein fluorescence microscope×100

表1 轉(zhuǎn)染24、48 h后Tie2 mRNA的相對表達量Tab 1 The relative expression of Tie2 after transfected 24 h and 48 h

2.3 Western blot檢測結(jié)果

各組細胞Tie2、α-tuburlin的Western blot結(jié)果見圖2：實驗組Tie2基因24、48 h條帶均明顯弱于陰性對照組和空白對照組，而兩個對照組間的表達強弱無明顯差異；實驗組48 h的Tie2條帶明顯弱于實驗組24 h的條帶。對Western blot條帶進行半定量分析（Tie2與α-tuburlin顯影灰度值的比值），空白對照組、陰性對照組和實驗組培養(yǎng)48 h時的灰度值分別為：1.089±0.134、1.024±0.408、0.466±0.037，培養(yǎng)24 h時的灰度值分別為0.983±0.036、0.985±0.724、0.722±0.078。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組48、24 h的灰度值分別與相同培養(yǎng)時間的兩個對照組比較，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實驗組低于對照組；實驗組48、24 h的灰度值進行比較，其差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 HUVECs凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

實驗組出現(xiàn)凋亡的細胞數(shù)目明顯增多，尤以48 h較為明顯；而陰性對照組、空白對照組的細胞凋亡不明顯。各組細胞的凋亡率見表2。采用卡方檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，可見3組間細胞凋亡率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 Wesern blot檢測結(jié)果Fig 2 Results of Western blot test

表2 細胞凋亡結(jié)果的統(tǒng)計分析

Tab 2 The statistical analysis of apoptosis

χ2值P值未凋亡率/%65.00.000陰性對照組4.995.1空白對照組2.897.2 323.009組別凋亡率/%實驗組35.0

2.5 轉(zhuǎn)染后各組細胞的增殖情況

MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后HUVECs的增殖情況，其結(jié)果見圖3。

圖3 pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA對HUVECs增殖的影響Fig 3 The effect of pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA on the proliferation of HUVECs

由圖3可見：實驗組在轉(zhuǎn)染了pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA后，細胞仍有增殖，但較空白對照組和陰性對照組緩慢得多（P＜0.05）；而兩個對照組的細胞增殖良好，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

Tie2在腫瘤血管生成中起著極為重要的作用。研究[2-4]發(fā)現(xiàn)：Tie2在許多惡性腫瘤如肝癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等出現(xiàn)表達上調(diào)現(xiàn)象。還有研究[5]報道：Tie2在口腔癌組織的表達明顯高于正常對照組織，并隨臨床病理分級的增加呈現(xiàn)遞增的趨勢。部分阻斷血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）途徑且無生物學(xué)反應(yīng)的腫瘤常表達Tie2，提示Tie2是腫瘤血管生成中另一條獨立的調(diào)控途徑[6]。

Tie2參與血管生成調(diào)節(jié)的機制可能是因為Tie2與其配體Ang結(jié)合后激活PI3-K/Akt信號途徑，從而導(dǎo)致血管形成、內(nèi)皮細胞遷移等[7]。Tie2基因是特異性表達于內(nèi)皮細胞和某些造血祖細胞的酪氨酸激酶受體，國外大部分有關(guān)Tie2基因的體外研究都是建立在血管內(nèi)皮細胞的基礎(chǔ)上[8]。本實驗的前期研究[9]結(jié)果提示：Tie2在HUVECs中呈高表達水平，與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相符。

本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，將含有Tie2基因特異性shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HUVECs。QRT-PCR結(jié)果顯示：就同一時間點而言，轉(zhuǎn)染HUVECs 24、48 h后，實驗組Tie2 mRNA的相對表達量分別只有相應(yīng)時間點的空白對照組的0.392倍和0.363倍；就同一對照組而言，轉(zhuǎn)染HUVECs 24、48 h后，實驗組Tie2 mRNA的相對表達量分別只有空白對照組（24 h）的0.392倍和0.543倍。此外，空白對照組培養(yǎng)48 h的Tie2 mRNA相對表達量也增高，由此推測，實驗組轉(zhuǎn)染48 h的Tie2 mRNA相對表達量比轉(zhuǎn)染24 h高可能是由于基因拷貝所致，此機制仍需進一步研究。上述結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染的pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA能夠顯著抑制Tie2基因的表達，且轉(zhuǎn)染后48 h的HUVECs中Tie2 mRNA的表達量低于轉(zhuǎn)染后24 h。Western blot結(jié)果顯示：HUVECs經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，Tie2蛋白表達明顯低于陰性對照組和空白對照組，且實驗組轉(zhuǎn)染48 h的Tie2蛋白表達量顯著低于轉(zhuǎn)染24 h（P＜0.05），而兩個對照組之間的差異則沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。此外，陰性對照組和空白對照組轉(zhuǎn)染48 h的Tie2基因表達量有所增高，但實驗組轉(zhuǎn)染48 h的Tie2基因表達量卻進一步下降，說明轉(zhuǎn)染的pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA顯著抑制了Tie2基因的表達。而引起陰性對照組和空白對照組培養(yǎng)48 h后Tie2基因表達量有所增高的原因，可能是由于上樣量誤差或是基因隨時間有所拷貝所致，此機制仍需進一步研究。

本研究結(jié)果提示：實驗組轉(zhuǎn)染48 h后的細胞凋亡率達到35.0%，明顯高于兩個對照組（P＜0.05），提示Tie2-shRNA沉默了HUVECs中的Tie2基因后能誘導(dǎo)細胞的凋亡，進一步證實了Tie2在HUVECs中的作用。MTT結(jié)果顯示：實驗組在轉(zhuǎn)染了pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA后，細胞仍有增殖，但較空白對照組和陰性對照組緩慢得多（P＜0.05），提示pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA顯著抑制了HUVECs的增殖。上述結(jié)果均提示Tie2的表達與內(nèi)皮細胞生物學(xué)活性密切相關(guān)。誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡、減少腫瘤血管生成可抑制腫瘤的生長，而本研究表明Tie2基因表達下調(diào)可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞增殖減緩、凋亡增多，提示沉默Tie2基因表達可能成為腫瘤治療的新途徑。

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