張梅華 于蘊之 繆羽

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院 口腔科，包頭014010；2.內(nèi)蒙古醫(yī)學院第四附屬醫(yī)院 口腔科，包頭014030）

破骨細胞核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）/骨保護素（osteoprotegerin，OPG）系統(tǒng)是影響破骨細胞分化、發(fā)育、調(diào)節(jié)的重要信號通路，也是全身因子和局部因子調(diào)節(jié)骨代謝的共同通路[1]。根尖周囊腫以及根尖周肉芽腫的發(fā)病機制錯綜復雜，至今尚未完全闡明。柳惠榮等[2]研究發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者齦溝液中RANKL濃度增高，OPG濃度下降，RANKL和OPG之間平衡失調(diào)，促進牙槽骨吸收。Zhang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在根尖周病變活動期RANKL表達增加而OPG表達降低，病變的靜止期或修復期RANKL表達降低而OPG表達增加。隨著RANKL和OPG調(diào)控失衡引發(fā)骨吸收理論的出現(xiàn)，人們對根尖周病變骨破壞的認識轉(zhuǎn)向到炎癥發(fā)生和調(diào)控上。本研究采用免疫組織化學法，檢測RANKL和OPG在根尖周囊腫和根尖周肉芽腫中的表達水平，并分析其相關關系，旨在觀察兩因子在根尖周囊腫、根尖周肉芽腫和正常牙周組織中的表達規(guī)律，探討RANKL和OPG在不同根尖周疾病周圍骨質(zhì)破壞機制中的作用，從而為根尖周囊腫和根尖周肉芽腫的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2008年9月—2011年1月到內(nèi)蒙古醫(yī)學院第四附屬醫(yī)院就診的因根尖周囊腫拔除的患牙，取其囊腫組織20例為囊腫組，其中男12例，女8例，平均年齡（32.35±4.76）歲；收集不愿意治療或根管治療失敗要求拔除的根尖周肉芽腫患牙，取其根尖周肉芽腫組織20例為肉芽腫組，其中男11例，女9例，平均年齡（30.55±7.39）歲；收集同時間、因正畸需要拔除的正常無病變牙的牙周膜組織20例為對照組，其中男8例，女12例，平均年齡（29.30±2.54）歲。3組的年齡、性別均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。所有研究對象均排除有全身系統(tǒng)性疾病者（如糖尿病、骨代謝性疾病及甲亢等），同時排除更年期婦女。

本課題中涉及到人體的實驗設計以及實驗操作規(guī)程，均得到捐獻者的知情同意，并經(jīng)過內(nèi)蒙古醫(yī)學院倫理委員會審核準予執(zhí)行。

1.2 主要試劑和儀器

免疫組織化學染色試劑盒Histostain-Plus Kit（Invitrogen公司，美國）：試劑A（藍色液體）為封閉用正常山羊血清工作液，試劑B（黃色液體）為生物素化二抗工作液，試劑C（橙色液體）為辣根酶標記鏈霉卵白素工作液。DAB試劑盒（Invitrogen公司，美國）。RANKL及OPG抗體（Santa Cruz公司，美國）均為1∶100稀釋。25%戊二醛（國藥集團化學試劑北京有限公司），10%甲醛（張家口市化學試劑廠）。

KD-BM型生物組織包埋機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司），Leica 2016型切片機、TK-C1381-EG病理圖像分析系統(tǒng)、全自動組織脫水機（Leica公司，德國），SHA-C型水浴鍋（金壇市榮華儀器制造有限公司），光學顯微鏡（Nikon公司，日本），KDC-16H高速離心機（合肥科大創(chuàng)新股份有限公司），普通冰箱（Siemens公司，德國），電熱恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠），DW86L386型超低溫保存箱（青島海爾集團），顯微攝像系統(tǒng)（Olympus公司，日本）。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織石蠟切片準備 將標本從10%甲醛中取出脫水，脫水程序：自來水沖洗過夜，75%乙醇2 h，85%乙醇2 h，95%乙醇1 h，100%乙醇1 h×2次。二甲苯透明20 min×2次，浸蠟55 ℃，切片，厚度為4 μm，60 ℃烤片4 h。

1.3.2 免疫組織化學操作過程 1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水（二甲苯Ⅰ8 min，二甲苯Ⅱ8 min，無水乙醇5min，95%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，流水沖洗5 min）。2）抗原修復：將切片連同檸檬酸緩沖液放入高壓鍋內(nèi)，加熱至產(chǎn)生噴氣，并持續(xù)2 min，壓力鍋離開熱源。3）取出并恢復至室溫，PBS液沖洗，3 min×3次。4）3%H2O2去離子水（無色液體）孵育20 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS液沖洗，3 min×3次。5）滴加試劑A室溫孵育10～15 min，傾去，勿洗。6）滴加適當比例稀釋的一抗（1∶100），陰性對照以PBS代替一抗。放入濕盒內(nèi)4 ℃過夜。7）取出并恢復至室溫，PBS液沖洗，3 min×3次。8）滴加試劑B室溫或37 ℃孵育10～15 min，PBS液沖洗，3 min×3次。9）滴加試劑C室溫或37 ℃孵育15 min，PBS液沖洗，3 min×3次。10）DAB顯色劑顯色，自來水充分沖洗約5 min，蘇木素復染，脫水，透明。中性樹脂封片。

1.4 陽性結(jié)果判定

先在光學顯微鏡低倍鏡下觀察整張切片，然后在高倍鏡下每張切片選10個視野，取各視野陽性細胞表達的平均值（個）作為陽性細胞表達值。同時采用形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)對各組免疫組織化學染色切片隨機采集、放大、輸入計算機，每個標本兩張切片，每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），觀測RANKL和OPG的表達及病變。顯微鏡下觀察到細胞漿及核膜上呈棕色或褐色顆粒，為陽性染色（即陽性表達）。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料描述以±s表示。3組間的比較，先在正態(tài)分布和方差齊同的條件下對3組進行單因素方差分析，然后采用q檢驗進行任意兩組間的比較。各組RANKL和OPG的相關性分析采用直線相關，先繪制散點圖，并求其相關系數(shù)r，再做顯著性檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組間RANKL和OPG表達的比較

3組間RANKL和OPG的表達及比較見圖1、2和表1、2。1）囊腫組、肉芽腫組、對照組中，RANKL的表達分別為75.00±7.54、68.40±6.74和29.40±2.46，方差齊性檢驗P=0.12＞0.1，表明方差齊同。單因素方差分析P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義，進一步兩兩比較，任兩組之間比較均為P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義，從高到低依次為囊腫組、肉芽腫組和對照組。2）囊腫組、肉芽腫組、對照組中，OPG的表達分別為38.10±7.09、47.65±13.85和58.60±5.88，方差齊性檢驗P=0.11＞0.1，表明方差齊同。單因素方差分析P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義，進一步兩兩比較，任兩組之間比較均為P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義，從低到高依次為囊腫組、肉芽腫組和對照組。

圖1 囊腫組（左）、肉芽腫組（中）和對照組（右）RANKL陽性表達 免疫組織化學×400Fig 1 The positive expression of RANKL among the cyst group（left）,granuloma group（medium）and control group（right）immunohistochemistry×400

圖2 囊腫組（左）、肉芽腫組（中）和對照組（右）OPG陽性表達 免疫組織化學×400Fig 2 The positive expression of OPG among the cyst group（left）,granuloma group（medium）and control group（right）immunohistochemistry×400

表1 3組間RANKL和OPG的表達及比較Tab 1 The expression and comparison of RANKL and OPG among three groups

2.2 RANKL和OPG的相關性分析

囊腫組中RANKL與OPG的相關性散點圖呈線性趨勢（圖3），相關系數(shù)r=-0.56，P=0.01，說明囊腫組中RANKL與OPG呈負相關關系。肉芽腫組其相關系數(shù)r=-0.388，P=0.091，對照組其相關系數(shù)r=0.059，P=0.805，且二者散點圖均不成線性趨勢，說明肉芽腫組和對照組中RANKL和OPG無相關關系。

表2 3組間RANKL和OPG表達的兩兩比較Tab 2 Any two groups expression comparison of RANKL and OPG among three groups

圖3 囊腫組RANKL、OPG的相關性分析Fig 3 The correlation analysis of RANKL and OPG in the cyst group

3 討論

目前關于RANKL和OPG因子在根尖周囊腫及根尖周肉芽腫周圍骨破壞和吸收中作用的研究卻較少。本實驗中利用免疫組織化學技術，檢測到了RANKL的表達在三組間差異均有統(tǒng)計學意義，囊腫組＞肉芽腫組＞對照組，說明RANKL的表達隨病變發(fā)展而增加，這符合根尖周肉芽腫和囊腫均是頜骨的溶骨性病變，且RANKL在正常牙周膜中的表達也是骨正常代謝活動的表現(xiàn)。OPG的表達在3組間的差異也有統(tǒng)計學意義，囊腫組＜肉芽腫組＜對照組，顯示肉芽腫組中OPG較囊腫組增強，其對破骨細胞激活的抑制作用也隨之增強，致使骨吸收活動減弱。OPG是RANKL的誘騙受體，通過與表達在成骨細胞表面和T細胞表面的破骨細胞核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor κB，RANK）結(jié)合，競爭性地抑制RANKL與受體RANK之間的信號傳導，從而抑制RANKL對破骨細胞的生成激活等誘導作用[4]，隨著病變程度的加重，RANKL在囊腫組中的表達較肉芽腫組增加，說明根尖周肉芽腫患牙未經(jīng)過正規(guī)徹底的治療，會發(fā)展為根尖周囊腫，根尖周囊腫的周圍破壞較肉芽腫范圍大。RANKL的高表達又促進了骨吸收的進程，根尖周組織的骨破壞進一步加重，這一點與臨床表現(xiàn)相同。

Sabeti等[5]采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應，對21個人類根尖周病損組織中RANKL和OPG的mRNA表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣本中均有其mRNA表達。RANKL可能與慢性根尖周炎骨吸收活動關系密切，同時RANKL和OPG可能在根尖周病變的疾病進展中具有重要作用。本研究中，對RANKL和OPG兩因子進行了相關性分析，發(fā)現(xiàn)囊腫組中兩因子呈負相關關系（r=-0.56，P＜0.05），而肉芽腫組和對照組則無相關關系。在根尖周囊腫中，隨著RANKL增加，OPG表達減少，這可能是因為在根尖周囊腫病變活動期，骨吸收活躍，而根尖周肉芽腫中，致病力相對較弱，骨吸收和骨形成相對較平衡，病變發(fā)展較緩和。

通常人們認為根尖周肉芽腫只需進行根管治療即可解決問題，但是在臨床上很多根尖周肉芽腫患者在根管治療后幾年內(nèi)，根尖周肉芽腫繼續(xù)長大，繼續(xù)破壞周圍骨質(zhì)。而根尖周囊腫則可引起頜骨膨脹，致唇頰側(cè)骨壁吸收變薄，甚至發(fā)生病理性骨折。所以系統(tǒng)了解根尖周病變骨破壞的機制，實施恰當有效的診治方案顯得尤為重要。唐華[6]在誘發(fā)大鼠牙周炎動物模型中采用OPG重組質(zhì)粒局部注射法進行研究，發(fā)現(xiàn)OPG基因制劑治療能夠有效地抑制破骨細胞的分化和活性，減緩牙周炎導致的牙槽骨喪失。Kim等[7]和Hofbauer等[8]提出了可滲透細胞的RANK受體抑制劑（RANK receptor inhibitor，RRI），認為RRI在骨質(zhì)疏松等骨骼疾病的治療中具有潛在作用。因此糾正RANKL/OPG的失衡可能成為治療慢性根尖周病的新途徑。當然這還需要大量的動物實驗與臨床實驗的支持與論證。

[1]Findlay DM,Haynes DR.Mechanisms of bone loss in rheumatoid arthritis[J].Mod Rheumatol,2005,15（4）：232-240.

[2]柳惠榮,張子彥,郭麗香.慢性牙周炎患者齦溝液OPG和RANKL的變化及意義[J].實用口腔醫(yī)學雜志,2008,24（1）：131-135.

Liu Huirong,Zhang Ziyan,Guo Lixiang.Change and significance of the receptor activator for NF-κB ligand and osteoprotegerin in gingival crevicular fluid in patients with chronic periodontitis[J].J Pract Stomatol,2008,24（1）：131-135.

[3]Zhang X,Peng B.Immunolocalization of receptor activator of NF kappa B ligand in rat periapical lesions[J].J Endod,2005,31（8）：574-577.

[4]陳麗萍,楊富生,吳禮安.骨保護素的有關研究[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2007,17（6）：361-363.

Chen Liping,Yang Fusheng,Wu Li’an.Relevant research of osteoprotegerin[J].Chin J Conserv Dent,2007,17（6）：361-363.

[5]Sabeti M,Simon J,Kermani V,et al.Detection of receptor activator of NF-kappa beta ligand in apical periodontitis[J].J Endod,2005,31（1）：17-18.

[6]唐華.人骨保護素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染抑制大鼠實驗性牙周炎骨吸收的研究[D].成都：四川大學,2000.

Tang Hua.Inhibitory effect of plasmid delivery of osteoprotegerin on alveolar bone resorption resulting from experimental periodontitis in rats[D].Chengdu：Sichuan University,2000.

[7]Kim H,Choi HK,Shin JH,et al.Selective inhibition of RANK blocks osteoclast maturation and function and prevents bone loss in mice[J].J Clin Invest,2009,119（4）：813-825.

[8]Hofbauer LC,Zeitz U,Schoppet M,et al.Prevention of glucocorticoid-induced bone loss in mice by inhibition of RANKL[J].Arthritis Rheum,2009,60（5）：1427-1437.