沈頡飛 王海業(yè) 麻穎宜 劉云飛 張書垣 杜莉

（口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)，成都610041）

生命體不斷感受著生存環(huán)境中的力學(xué)刺激，這些生物力作用方式包括剪切力、拉伸力等，這些刺激可影響細(xì)胞本身的生理特性[1]。作為生物力學(xué)中的特殊類別，滲透壓在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用舉足輕重，研究表明：調(diào)節(jié)細(xì)胞外液滲透壓可以影響神經(jīng)的動作電位傳導(dǎo)[2]、周邊神經(jīng)的痛覺傳導(dǎo)[3]以及大腦神經(jīng)細(xì)胞突觸和腦垂體細(xì)胞電壓門控鈉離子通道（voltage-gated sodium channels，VGSCs）的動力學(xué)參數(shù)等[4-5]。

作為主要負(fù)責(zé)口腔頜面部感覺傳導(dǎo)的三叉神經(jīng)，它的生理基礎(chǔ)是由電壓門控離子通道共同參與的動作電位傳導(dǎo)，在這一過程中廣泛存在于三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（trigeminal ganglion neuron，TRGN）上的VGSCs起到了關(guān)鍵作用[6]。有研究已經(jīng)證明：改變細(xì)胞外滲透壓可以影響三叉神經(jīng)細(xì)胞上電壓門控鉀離子通道（voltage-gated potassium channels，VGPCs）的峰值電流密度、失活曲線[7-8]，以及電壓門控鈣離子通道（voltage-gated calcium channels，VGCCs）的電流電壓關(guān)系曲線[9]。生物體滲透壓平衡由細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外環(huán)境共同決定，然而關(guān)于改變細(xì)胞內(nèi)滲透壓所帶來的具體影響依然沒有被闡述，細(xì)胞內(nèi)滲透壓濃度主要由Na、K和Cl 3種離子共同決定[10]，VGSCs在保證胞內(nèi)離子平衡上扮演了重要角色，該通道的表達(dá)與三叉神經(jīng)受損[11]和三叉神經(jīng)痛[12]也有密切關(guān)系，因此研究該通道在胞內(nèi)不同滲透壓影響下所發(fā)生的電生理特性改變，具有一定的生理意義。

本研究通過膜片鉗全細(xì)胞記錄法詳細(xì)記錄TRGN上VGSCs的激活和失活過程，并將因細(xì)胞內(nèi)高滲透和低滲透刺激所帶來的電生理特性改變進(jìn)行對比，為進(jìn)一步推測其可能的機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 TRGN細(xì)胞的獲取

實(shí)驗(yàn)動物的獲取及處理過程均由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室倫理委員會批準(zhǔn)。TRGN從SD乳鼠分離出來后，用Hanks平衡液（Hanks’balanced salt solution，HBSS）清洗，平衡液的組成：130 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1KCl、0.3 mmol·L-1KH2PO4、4 mmol·L-1NaHCO3、0.3 mmol·L-1Na2HPO4·12H2O、5.6 mmol·L-1D-葡萄糖、10 mmol·L-1羥乙基哌嗪乙磺酸（hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，HEPES），pH=7.4。然后將剪碎的神經(jīng)節(jié)轉(zhuǎn)移至裝有1.5 mL消化液（含20 U·mL-1木瓜蛋白酶，Sigma公司，美國）的EP管中，將其置于37 ℃的恒溫水浴箱內(nèi)消化48～50 min，然后再加入約1 mL DMEM/F-12（體積比1∶1）混合培養(yǎng)基，由大至小用不同口徑的Pasteur吸管輕柔反復(fù)地吹打組織塊約8 min，直至形成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種于35 mm培養(yǎng)皿中經(jīng)過多聚賴氨酸處理的蓋玻片上，轉(zhuǎn)移至37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，使神經(jīng)細(xì)胞貼壁50～60 min，然后在上機(jī)之前用細(xì)胞外液完全置換培養(yǎng)基，以備下一步操作。

1.2 細(xì)胞內(nèi)液高滲和低滲的形成

根據(jù)細(xì)胞內(nèi)液滲透壓的高低，將實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞分為3組，分別為對照組（306 mOsm組）、低滲組（260 mOsm組）、高滲組（350 mOsm組）。應(yīng)用滲透壓摩爾濃度測定儀通過控制D-甘露醇在電極內(nèi)液中的量，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓。等滲細(xì)胞內(nèi)液組成為：110 mmol·L-1CsCl、10 mmol·L-1NaCl、0.1 mmol·L-1CaCl2、10 mmol·L-1HEPES、11 mmol·L-1乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸[ethyleneglycol bis（2-aminoethyl ether）tetraacetic acid，EGTA]、70 mmol·L-1D-甘露醇，pH=7.3，滲透壓為306 mOsm。低滲電極內(nèi)液不含有D-甘露醇，pH=7.3，滲透壓為260 mOsm。高滲電極內(nèi)液D-甘露醇的量為106 mmol·L-1，pH=7.3，滲透壓為350 mOsm。細(xì)胞外液組成均為：60 mmol·L-1氯化膽堿、60 mmol·L-1NaCl、20 mmol·L-1氯化四乙銨（tetraethylammonium chloride，TEA-Cl）、5 mmol·L-1KCl、5 mmol·L-1MgCl2·6H2O、2 mmol·L-1CaCl2、0.1 mmol·L-1CdCl2·5H2O、20 mmol·L-1D-葡萄糖、10 mmol·L-1HEPES，pH=7.4，滲透壓為306 mOsm。

1.3 VGSCs的全細(xì)胞膜片鉗記錄

VGSCs的全細(xì)胞電壓膜片鉗記錄采用Axopatch 200B膜片鉗放大器、Digidata 1200數(shù)模轉(zhuǎn)換器，采樣頻率為10 kHz，低通濾波頻率為1 kHz，電容和串聯(lián)電阻的補(bǔ)償≥90%，電極電阻約為2～4 mΩ。激活電流刺激程序：先使TRGN細(xì)胞破膜后保持在-60 mV的電位，超級化至-80 mV保持70 ms作為預(yù)刺激電位，然后從-60 mV開始以10 mV為步階去極化至+60 mV，間隔2 s，整個時程為50 ms。失活電流刺激程序：將細(xì)胞電位鉗制在-60 mV，然后給予-80～0 mV、時程為50 ms、步階10 mV的預(yù)刺激，再從預(yù)刺激位點(diǎn)去極化至0 mV，間隔4 s，并保持50 ms（圖1）。

圖1 VGSCs電流的刺激程序波形Fig 1 The stimuli waveforms for VGSCs currents

用電流密度來表示全細(xì)胞電流強(qiáng)度，即電流密度為電流強(qiáng)度值與各個TRGN全細(xì)胞電容值的比值，單位為pA/pF，優(yōu)點(diǎn)在于統(tǒng)計(jì)比較更標(biāo)準(zhǔn)化。對于標(biāo)準(zhǔn)激活和失活曲線的繪制，是根據(jù)相應(yīng)的電流和電壓關(guān)系，即I-V曲線（current-voltage relationship curve），再按標(biāo)準(zhǔn)步驟繪制形成G-V曲線。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Clampfit 10.0（Axon Instruments Inc.，美國）進(jìn)行圖形分析，然后在Origin 7.0（Microcal Software Inc.，美國）軟件包內(nèi)分別使用Boltzmann方程G/Gmax=1/[1+exp（V0.5-Vm）/k]和I/Imax=1/[1+exp（V0.5-Vm）/k]對激活曲線和失活曲線進(jìn)行擬合，其中Vm為膜電位，V0.5為半激活或激活電位，k為斜率因子。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，在SPSS 17.0軟件包中運(yùn)用單因素方差分析來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)中，一共27個TRGN細(xì)胞被納入記錄范圍，每組分別為9個細(xì)胞；此外選取細(xì)胞胞體直徑在15～25 μm的TRGN細(xì)胞作為研究對象，來檢測不同濃度胞內(nèi)滲透壓對VGSCs電生理特性的影響。在電極破膜形成高阻封接后，為了保證電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液的完全置換，在前5 min內(nèi)不做任何記錄，這主要是因?yàn)槲㈦姌O的體積要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于神經(jīng)細(xì)胞體積，因此在經(jīng)過完全置換后，可以認(rèn)為電極內(nèi)液的滲透壓約等于細(xì)胞內(nèi)液滲透壓。

2.1 不同濃度細(xì)胞內(nèi)液滲透壓對VGSCs電流波形和I-V關(guān)系的影響

在不同濃度細(xì)胞內(nèi)液滲透壓的作用下，典型的VGSCs激活電流和失活電流波形見圖2，I-V曲線見圖3。這些波形與以往關(guān)于VGSCs在TRGN及其他神經(jīng)的研究有著類似的波形特征[13-14]。低滲組激活電流I-V關(guān)系與對照組相比，曲線有一定程度的上移；但高滲組曲線整體變化并不大。

圖2 不同濃度滲透壓對VGSCs電流波形的影響Fig 2 Effects of osmolality changes on the VGSCs currents

圖3 260、306、350 mOsm作用下的典型I-V曲線Fig 3 The typical I-V curves under effects of 260,306,350 mOsm osmolality

2.2 不同濃度細(xì)胞內(nèi)液滲透壓對VGSCs激活特性的影響

當(dāng)膜電位去極化至-30 mV時，高滲組和低滲組開始激活，并且在+30 mV達(dá)到最大激活；細(xì)胞內(nèi)低滲透壓刺激下，G-V曲線輕微地向去極化方向偏移，但3組之間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。然而，在細(xì)胞內(nèi)高滲透壓作用下，激活曲線略向超級化方向偏移（圖4）。分析結(jié)果顯示：3組峰值電流密度以及激活曲線的V0.5值間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在高滲透壓作用下激活曲線的k值與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

圖4 260、306、350 mOsm作用下標(biāo)準(zhǔn)G-V曲線Fig 4 The typical G-V curves under effects of 260,306,350mOsm osmolality

表1 VGSCs激活曲線的擬合結(jié)果Tab 1 The fitting results of VGSCs activation curves

2.3 不同濃度細(xì)胞內(nèi)液滲透壓對VGSCs失活特性的影響

在260 mOsm滲透壓作用下，失活曲線明顯地朝向去極化方向移動（圖5）。

圖5 260、306、350 mOsm作用下標(biāo)準(zhǔn)失活曲線Fig 5 The typical inactivation curves under effects of 260,306,350 mOsm osmolality

3組均是當(dāng)膜電位達(dá)到-60 mV時才開始緩慢失活；當(dāng)膜電位達(dá)到0 mV時，低滲組失活達(dá)到最大值；而對于對照組和高滲組則是膜電位達(dá)到-10 mV時才達(dá)到最大失活。

對照組和高滲組、低滲組和高滲組失活速率（最小電流密度/最大電流密度）間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對照組和低滲組失活曲線的V0.5差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同濃度細(xì)胞內(nèi)滲透壓作用下，失活曲線的k值與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 VGSCs失活曲線的擬合結(jié)果Tab 2 The fitting results of VGSCs inactivation curves

3 討論

改變細(xì)胞外液滲透壓可以對三叉神經(jīng)細(xì)胞上的電壓門控離子通道的電生理特性產(chǎn)生一系列影響[7-8]。在Chen等[15]關(guān)于TRGN上VGSCs的研究中，在不同濃度細(xì)胞外液滲透壓作用下，非河豚毒素依賴性（TTXR）鈉離子的電流大小可以在一定程度上被抑制；在高滲環(huán)境下，電壓依賴性的激活和失活曲線都往超級化的方向移動，而在低滲環(huán)境下僅僅失活曲線朝向超級化方向偏移。這些現(xiàn)象可能的機(jī)制是，細(xì)胞外液高滲或低滲刺激可分別通過cAMP依賴性蛋白激酶A或脂質(zhì)級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的反饋?zhàn)饔梅绞秸{(diào)節(jié)鈉離子通道電生理特性[15]。類似的作用在瞬時感受器電位香草酸受體1[16]、VGCCs[5，9，17]及VGPCs[8，18]上也有所體現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，在低滲刺激下整體失活曲線和最大失活電壓都明顯地朝著去極化方向偏移，此外用k值來表示的失活速率也有所減??；但是，VGSCs的激活波形以及動力學(xué)參數(shù)并沒有明顯的改變。而在高滲環(huán)境下，激活曲線和失活曲線都朝著超級化方向移動，這些變化與斜率k值的變化有一定的相關(guān)性，但是V0.5的變化并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？紤]到細(xì)胞內(nèi)液低滲刺激類似于細(xì)胞外液高滲的作用（反之亦然），在同一程度上的滲透壓改變，可以看出由細(xì)胞內(nèi)液滲透壓改變給VGSCs電流激活和失活特性所帶來影響程度，要大于且廣于由Liu等[13]描述的細(xì)胞外液滲透壓改變所帶來的影響。

電壓門控離子通道的激活和失活機(jī)制如下。電壓門控鈉離子通道是由一個α亞基和一個或多個β亞基構(gòu)成的復(fù)合體[6]，以往的研究揭示了每一個α亞基由4個相似或相同的跨膜結(jié)構(gòu)域（I-IV）構(gòu)成，四者對稱排列形成一個中央離子孔道，而每一個結(jié)構(gòu)域含有6次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)（S1-S6），其中S4為電壓感受器[19]。Long等[20]研究表明：在KvAP和Kv1.2組成結(jié)構(gòu)中，S3的第二部分（S3b）和S4共同形成了一個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，即電壓感受器槳狀構(gòu)型，該結(jié)構(gòu)對于離子通道的開放具有重要意義。而被α螺旋膜電位感受器所包繞KvAP代表著典型的電壓門控離子通道構(gòu)型[19]，因此這一構(gòu)象也可適用于VGSCs，可以推測當(dāng)VGSCs被激活后，船槳樣結(jié)構(gòu)開始由胞內(nèi)向胞外移動的同時，S6螺旋發(fā)生旋轉(zhuǎn)并向胞外移動，增大了通道孔道的直徑，從而通道逐漸開放。VGSCs的失活是一個快速失活過程，其中的機(jī)制可能是因?yàn)榍?鏈結(jié)構(gòu)[21]，在這一結(jié)構(gòu)中離子通道的N端含有系列氨基酸殘基，當(dāng)通道開始失活，這一系列氨基酸促使細(xì)胞內(nèi)孔道逐漸關(guān)閉[22-23]。

VGSCs的生理學(xué)作用不僅依賴于通道本身的構(gòu)象變化，而且與細(xì)胞的胞膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。無論是在細(xì)胞外液或者細(xì)胞內(nèi)液的滲透壓作用下，可能是直接通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜張力，導(dǎo)致位于細(xì)胞膜上的離子通道的構(gòu)架改變，從而使細(xì)胞膜上VGSCs電生理特性改變[24]。膜張力的改變主要影響離子通道的跨膜部分，在這一組分中位于VGSCs胞膜脂質(zhì)雙層中間的S4作用明顯[25]，而Kukita[26]也證明了S4在神經(jīng)感受外界滲透壓環(huán)境改變的過程中扮演著重要的角色，這也許是其可能機(jī)制之一。在實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)液低滲環(huán)境形成之后，隨著在壓力下細(xì)胞本身結(jié)構(gòu)和體積的穩(wěn)定，神經(jīng)細(xì)胞膜張力逐漸減小，離子通道可能不再發(fā)生收縮形變，因此可見在低滲透壓條件下，VGSCs的激活特性并沒有發(fā)生明顯改變。但是在細(xì)胞內(nèi)液處于高滲透壓的環(huán)境中時，隨著胞膜張力逐漸增加，VGSCs的S4段可能被拉伸，然后導(dǎo)致激活電流的電生理特性改變。

本實(shí)驗(yàn)通過描述改變細(xì)胞內(nèi)滲透壓的梯度所帶來的變化，進(jìn)一步明確了VGSCs在維持胞內(nèi)離子平衡中的重要作用，也為推斷三叉神經(jīng)痛及三叉神經(jīng)感覺異常的機(jī)制打下基礎(chǔ)。在口腔修復(fù)學(xué)領(lǐng)域，作為主要負(fù)責(zé)口腔頜面部感覺的三叉神經(jīng)，其與種植體植入的部位密切相關(guān)，因此如何選擇種植體的植入部位、植入方式，以及如何評估種植所帶來的各種影響，就成為口腔種植修復(fù)研究一個必不可少的課題，因此對VGSCs的電生理研究，也為此拓展了新的研究方向[27]。在這里應(yīng)該指出的是，以往關(guān)于細(xì)胞外液滲透壓作用于電壓門控離子通道的研究中，通過沖洗的方式可以移除細(xì)胞外液高滲或低滲刺激，方式更加客觀。而細(xì)胞內(nèi)液的滲透壓環(huán)境主要由電極內(nèi)液控制，在全細(xì)胞記錄過程中進(jìn)行液體置換不可避免的在一定程度上破壞高阻封接和細(xì)胞本身。因此，為了觀察通過調(diào)節(jié)電極內(nèi)液而改變細(xì)胞內(nèi)液滲透壓所帶來的后續(xù)影響，更為先進(jìn)的技術(shù)應(yīng)該被運(yùn)用到全細(xì)胞記錄過程中。

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