張淑英，余志金，甘愛華，許岸高

1.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江 524003;2.惠州市醫(yī)學(xué)研究所

遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌遺傳易感基因的研究現(xiàn)狀

張淑英1，余志金2，甘愛華2，許岸高2

1.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江 524003;2.惠州市醫(yī)學(xué)研究所

遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hereditary nonpolyposis colerectal cancer，HNPCC)與遺傳易感基因的突變有密切的關(guān)系，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HNPCC遺傳易感基因主要是錯配修復(fù)系統(tǒng)相關(guān)基因如MLH1、MSH2、MSH6和PMS2等。此外，miRNA及轉(zhuǎn)化生長因子受體等與HNPCC也有密切關(guān)系。單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single-strand conformation polymorphism，SSCP)是目前應(yīng)用較為廣泛且相對簡單的方法，但其手工操作繁雜、重復(fù)率較低，且結(jié)果往往因人而異、靈敏度不高。變性高效液相色譜分析 (denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC)和高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的新的序列分析技術(shù)，有望成為HNPCC較理想的分子篩查方法。

遺傳性;結(jié)直腸癌;易感性

遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hereditary nonpolyposis colerectal cancer，HNPCC)又名林奇綜合征(Lynch syndrome，LS)，是一種常染色體顯性遺傳病，它的發(fā)生和易感基因的突變有密切的關(guān)系。目前已經(jīng)證實(shí)，HNPCC的發(fā)生和錯配修復(fù)基因(mismatch repair，MMR)MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2 等突變有關(guān)，這些基因被認(rèn)為是HNPCC的易感基因。國外對這些基因進(jìn)行了深入的研究，而國內(nèi)對HNPCC家系的遺傳學(xué)檢測工作開展得相對較晚。因此，本文擬就 HNPCC遺傳易感基因的研究近況作一綜述。

1 常見易感基因

目前與 HNPCC相關(guān)的 MMR基因有 MLHl、MSH2、MSH6、PMS2等，約 90% 的突變發(fā)生于 MLH1和 MSH2［1］。

1.1 MLH1 MLH1 又名 mutL(E.coli)同源體，位于染色體3p21.3，全長58kb，含19個外顯子，由720個腺嘌呤、635個胸腺嘧啶、549個鳥嘌呤和535個胞嘧啶組成。我國有部分學(xué)者報(bào)道hMLH1是我國國民HNPCC的主要原因。我國HNPCC結(jié)腸外癌以胃癌為主［2］。Zhi等［3］研究發(fā)現(xiàn) MLH1 在胃癌的發(fā)生中扮演著決定性的作用，而且MLH1 2101C＞A突變可作為胃癌尤其是男性易感性的標(biāo)記。

全基因組低甲基化、局部區(qū)域啟動子CpG島過甲基化(hMLHl、CALCA、APC、p16等)是結(jié)直腸癌的表觀遺傳學(xué)特點(diǎn)。Auclair等［4］在110例散發(fā)的早期結(jié)直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)有55例(50%)患者的MLH1啟動子出現(xiàn)異常的過甲基化，高水平甲基化患者M(jìn)LH1基因表達(dá)減少且其腫瘤細(xì)胞同微衛(wèi)星不穩(wěn)定(micro satellite instability，MSI)相關(guān)。該研究還發(fā)現(xiàn)有1例構(gòu)成的甲基化影響兩個等位基因，提示post-zygotic甲基化調(diào)節(jié)異常。等位基因MLH1的單核苷酸多態(tài)性cDNA表達(dá)和構(gòu)成的甲基化可隱藏染色體的重新排序進(jìn)而導(dǎo)致 HNPCC［5］。吉敏［6］認(rèn)為 MLH1 啟動子近端區(qū)域過甲基化導(dǎo)致MLH1蛋白失表達(dá)，從而導(dǎo)致HNPCC發(fā)生，并且該機(jī)理同樣適用于MSH2。研究證明這種甲基化狀態(tài)在藥物干預(yù)下是可逆的。用甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷和5-氮胞苷等可誘導(dǎo)低甲基化，從而使失活的 MMR基因重新表達(dá)［7］。該研究為治療HNPCC提供一種新思路。

MLH1核心啟動子包含一個共同的單核苷酸多態(tài)性(－93G＞A，dbSNP ID:rs1800734)，－93G＞A位于對最大限度轉(zhuǎn)錄活動來說是必不可少的區(qū)域。-93G＞A多態(tài)性是MLH1基因最常見的突變［8］且已經(jīng)被提出為結(jié)直腸癌的低外顯率［4，9］變異型。Raptis等［10］發(fā)現(xiàn)安大湖和紐芬蘭兩個種群的MLH1-93G＞A多態(tài)性和MSI-H腫瘤有強(qiáng)相關(guān)性(安大湖患者P=0.001，紐芬蘭患者 P=0.003)。該研究同 Campbell等［11-12］的研究結(jié)果相符。然而Pan等［13］認(rèn)為MLH1-93G/A多態(tài)性同癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)沒有可信服的證據(jù)。理由是他們對文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析，依據(jù)文獻(xiàn)的質(zhì)量采用層狀分析，發(fā)現(xiàn)癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加在質(zhì)量低的文獻(xiàn)中而不在質(zhì)量高的文獻(xiàn)中。同樣的，癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加發(fā)現(xiàn)于以醫(yī)院為基礎(chǔ)的研究而不是基于人群的研究。從保守的觀點(diǎn)來看，應(yīng)采用精心設(shè)計(jì)的基于人群的不同種群的大樣本研究來進(jìn)一步證實(shí)這個結(jié)果。此外，研究還發(fā)現(xiàn)hMLH1-93G＞A多態(tài)性同前列腺癌［14］、非吸煙者肺癌風(fēng)險(xiǎn)［15］具有重要相關(guān)性。

關(guān)于 MLH1基因 c.1852_1853AA ＞GC(p.Lys618Ala)變異體的報(bào)道目前尚有爭議。最初因其在HNPCC家系的反復(fù)出現(xiàn)而被認(rèn)為是有害的變異。Pastrello等［16］將其歸類為致病性的基因。Perera等［17］研究發(fā)現(xiàn)它可以顯著降低蛋白的穩(wěn)定性，然而Castillejo等［18］研究證明了這種變異體對HNPCC沒有重要的意義。隨著檢測手段的提高，這些年不斷有新的突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)。如 MLH1:c.143A＞C(p.Q48P)、c.157_160deIGAGG、c.－64G ＞ T、c.2157dupT，PMS2:c.1532C ＞T 等。

此外，MLH1表觀遺傳學(xué)相關(guān)腫瘤的二次打擊是經(jīng)典的遺傳而非后天的原理已明確。雖然腫瘤的遺傳易感性通過顯性遺傳模式傳遞，但是腫瘤的發(fā)生要求余下的功能性等位基因體細(xì)胞缺失，這同 Knudson［19］的“二次打擊”學(xué)說相符。Goel等［20］在 7例患者的 8個腫瘤中發(fā)現(xiàn)MLH1的第2個等位基因缺失，該研究還報(bào)道了1例由父系等位基因遺傳引起HNPCC的表觀遺傳學(xué)，為表觀遺傳學(xué)起源的機(jī)制提供了重要的新的認(rèn)識。

1.2 MSH2 MSH2基因位于染色體的2p21-22，全長為73kb，含16個外顯子，由930個腺嘌呤、803個胸腺嘧啶、688個鳥嘌呤和526個胞嘧啶組成。1993年P(guān)eltomaki P.和Leach F.S發(fā)現(xiàn)了該基因。MSH2主要和MSH6或者M(jìn)SH3形成二聚體MutSα和MutSβ而發(fā)揮作用。前者修復(fù)堿基錯配、插入和缺失，后者修復(fù)插入和缺失。20% 懷疑有MSH2生殖細(xì)胞系突變且歸因于MSH2失表達(dá)的病例，并沒有鑒別出生殖細(xì)胞系的突變［21］。Chan 等［22］報(bào)道了一個突變 陰性的HNPCC家系中出現(xiàn)可遺傳的MSH2生殖細(xì)胞系表觀遺傳學(xué)。該家系3個兄弟姐妹出現(xiàn)MSH2基因特異等位基因生殖細(xì)胞系和體細(xì)胞過甲基化，均表現(xiàn)為MSI和MSH2蛋白缺失，且發(fā)生了早期結(jié)直腸癌或子宮內(nèi)膜癌。Ligtenberg等［23］研究認(rèn)為位于 MSH2上游約16kb區(qū)域的3’EpCAM基因(原名TACSTD1)的生殖細(xì)胞系的缺失是導(dǎo)致這種可遺傳的生殖細(xì)胞系表觀遺傳學(xué)的原因。其轉(zhuǎn)錄終止失敗導(dǎo)致MSH2下游轉(zhuǎn)錄融合基因EpCAM-MSH2的產(chǎn)生，進(jìn)而使MSH2啟動子過甲基化，尤其是在EpCAM呈高水平表達(dá)的上皮組織，從而導(dǎo)致了HNPCC的產(chǎn)生。Rumilla等［21］不僅證實(shí)了該研究，而且指出20% ～25%的懷疑有MSH2突變但事實(shí)上無該突變的病例可歸因于EpCAM/TACSTD1生殖細(xì)胞系缺失。

此外，Colon CFR鑒別出1例MSH2甲基化但MLPA未發(fā)現(xiàn)EpCAM/TACSTD1生殖細(xì)胞系缺失的患者。Rumilla等［21］分析認(rèn)為造成該現(xiàn)象的原因可能是該先證者為小缺失，不能為目前的MLPA探針檢測到，或者被認(rèn)為是介導(dǎo)MSH2啟動子異常過甲基化的Ep-CAM/TACSTD1轉(zhuǎn)錄終止信號的點(diǎn)突變導(dǎo)致了相同的RNA通讀。該病例表明少數(shù)病例可能發(fā)生其他的突變和/或體細(xì)胞事件。

MSH2基因是一些MSH2突變陰性的LS的生殖細(xì)胞系表觀遺傳學(xué)的另一個目標(biāo)，但是MSH2甲基化是嚴(yán)格意義上的生殖細(xì)胞系事件還是體細(xì)胞事件還不清楚。Nagasaka等［24］認(rèn)為它是可遺傳的體細(xì)胞事件，同Chan等［22-23］報(bào)道其為生殖細(xì)胞系事件不同。理由是其收集到的散發(fā)性HNPCC結(jié)直癌病例的MSH2甲基化的證據(jù)主要出現(xiàn)在 MSH2生殖細(xì)胞系突變的患者，而不是出現(xiàn)在后兩者報(bào)道的生殖細(xì)胞系突變陰性的病例。而且MSH2缺失的HNPCC病例在MSH2甲基化的腫瘤相應(yīng)的正常黏膜中沒有發(fā)生后天的缺陷，而不是這些個體中生殖細(xì)胞系突變。此外，在11個患者的3個中發(fā)現(xiàn)EpCAM缺失同MSH2過甲基化進(jìn)一步證明該觀點(diǎn)。

1.3 MSH6和PMS2 MSH6位于染色體的 2p16，主要和MSH2蛋白結(jié)合形成二聚體來發(fā)揮作用。MSH6在子宮內(nèi)膜癌人群中的突變率較高(9.77%)，以移碼突變及置換突變?yōu)橹?，外顯子4為主要突變部位，突變攜帶者發(fā)病年齡較晚，平均年齡為(54.8±2.8)歲［25］。值得注意的是，25%的MSH6為 MSS且主要位于末端結(jié)腸、缺乏結(jié)直腸癌家族史，倘若采用MSI檢測作為單一的篩查方法可能會導(dǎo)致漏診［26］。因此建議先采用 IHC和 MSI分析再結(jié)合基因測序篩查MSH6。此外，Sjursen等［27］認(rèn)為 Amsterdam 和 Bethesda的每項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)都不適合鑒別 MSH6突變攜帶者。MSH6突變可能比當(dāng)前預(yù)測的更加常見，來自符合目前臨床標(biāo)準(zhǔn)的家系的MSH6突變表達(dá)/外顯率可能被這兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)誤導(dǎo)了。綜合與MSH6有關(guān)的這些特征，這種基因?qū)NPCC的影響可能被低估。因此評估早期發(fā)生的結(jié)直癌應(yīng)包括評估 MSH6缺失，對于無MLH1或MSH2這兩個主要突變基因突變的病例應(yīng)考慮檢測其他易感基因，尤其是MSH6。

PMS2位于染色體的7p22.1，由于其在 HNPCC中突變率較低，關(guān)于該基因的研究目前較少。Sheng等［28］在一個符合Bethesda指南的中國HNPCC先證者中發(fā)現(xiàn)目前在中國HNPCC家系尚未報(bào)道過且在PMS2-SNP數(shù)據(jù)庫中未能找到的hPMS2基因胚系突變，該突變?yōu)?1號外顯子c.1532C＞T的錯義突變。hPMS2胚系的突變在中國的HNPCC家系中少見，第2號和第5號外顯子為hPMS2基因的SNP熱點(diǎn)。此外，Soni等［14］證明低分化腫瘤的PMS2蛋白有較大的缺失，值得注意的是PMS2基因表達(dá)和格里森評分呈負(fù)相關(guān)相一致，表明它作為前列腺癌進(jìn)展的重要標(biāo)志。

1.4 其他基因 約40% 符合LS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)直腸癌家系并不是由 MMR缺失引起的［29］。因此推測可能有除了MMR基因以外的其他HNPCC易感基因。研究發(fā)現(xiàn)TGFBR16A的等位基因的頻率在MMR突變陰性的患者(0.195)比 MMR突變陽性患者(0.104;P=0.011)的表達(dá)顯著增高，在 MMR突變陰性的且無 MSI的患者中的頻率更高(0.211)，故 TGFBR16A可能是一部分 HNPCC發(fā)病原因［30］。MicroRNA是基因表達(dá)調(diào)控一個新領(lǐng)域，它通過擔(dān)任致癌基因或抑癌基因的角色導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。MicroRNA的表達(dá)與 MSI及 HNPCC密切相關(guān)［31］，其中，MMR缺失原因不明的MSI腫瘤歸因于miR_155的過表達(dá)，miR_155通過下調(diào)MMR異質(zhì)二聚體蛋白 MSH2-MSH6和MLH1-PMS2起作用［32］。BRAFV600E突變以 100%的特異和48% 的敏感性出現(xiàn)在分散性MSI-H的腫瘤中但不出現(xiàn)在LS中，因此，BRAF陽性突變幾乎排除了 LS［33］。

2 易感基因的檢測方法

目前常用的檢測方法有IVSP、PCR-SSCP、蛋白截短實(shí)驗(yàn)、雜合雙顯性分析變性、凝膠電泳和直接測序等，然而這些方法均不能檢測到所有的MMR基因突變。

2.1 SSCP SSCP是目前應(yīng)用最為廣泛且相對簡單的方法，但由于完全是手工操作且重復(fù)率較低，結(jié)果往往因人而異，靈敏度不高。

2.2 DHPLC DHPLC是近幾年發(fā)展起來的新的序列分析技術(shù)，對 hMLH1和hMSH2進(jìn)行基因突變篩查的敏感性和特異性(分別為100%和93.3%)均高于SSCP(51.6%和66.6%)，是理想的分子遺傳學(xué)檢測方法［34］。

2.3 HRM HRM是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上增加一種飽和染料，不需要使用序列特異性探針的檢測基因突變與基因分型的新的分子診斷技術(shù)。它不受突變堿基位點(diǎn)和種類的局限，既能分析已知的突變和短片段重復(fù)序列，還能掃描未知的突變。具有高靈敏度、高特異性、高通量、低成本、操作簡便及結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。HRM的這些優(yōu)點(diǎn)使其成為近年來國外新興的遺傳學(xué)研究熱點(diǎn)。

3 檢測HNPCC易感基因的意義及存在的問題

找出HNPCC相關(guān)的易感基因就可以通過測定基因突變情況估計(jì)攜帶者發(fā)生HNPCC的風(fēng)險(xiǎn)，并且進(jìn)行密切隨訪、定期檢查以及回避各種不利因素，以達(dá)到早診斷、早治療、降低發(fā)病率和死亡率的目的。但是由于HNPCC患者的發(fā)病年齡較輕，加上腫瘤進(jìn)展快，通過定期隨訪可能難以在極早期查出病灶。對于易感基因攜帶者還可以進(jìn)行化學(xué)預(yù)防或作預(yù)防性結(jié)腸切除術(shù)等。然而目前化學(xué)預(yù)防的效果尚難確定，預(yù)防性結(jié)腸切除術(shù)并不是一種理想的方法。

此外，由于HNPCC易感基因MMR基因突變位點(diǎn)位于整個編碼區(qū)，無突變熱點(diǎn)，往往需要進(jìn)行全基因測序。然而基因測序是耗時耗力且昂貴的檢測。根據(jù)Knudson［19］的“二次打擊”學(xué)說，攜帶有易感基因生殖細(xì)胞系突變的人群在生后的環(huán)境中遭遇二次打擊導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，而這種二次打擊可以是易感基因的另一個等位基因的突變或缺失。生活環(huán)境或飲食習(xí)慣等中的不良因素有可能對于已經(jīng)存在生殖細(xì)胞系突變的易感基因的等位基因造成“二次打擊”，而這種“二次打擊”何時形成無法估計(jì)。因此對易感基因攜帶者的基因檢測可能不止一次，普通家庭將難以承擔(dān)反復(fù)的檢測費(fèi)用。故建議對有家族史的人群進(jìn)行基因突變篩選。然而隨著我國家庭小型化日益明顯，部分家族史難以追溯，僅對有家族史的人群進(jìn)行篩查容易導(dǎo)致漏診。

綜上所述，目前與HNPCC密切相關(guān)的易感基因有 MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2等，MLH1和MSH2約占90%［1］。其中，MLH1是我國國民 HNPCC及其相關(guān)結(jié)腸外癌以胃癌為主的主要原因，MLH1 2101C＞A突變可作為胃癌尤其是男性易感性的標(biāo)記。－93G＞A多態(tài)性是MLH1基因最常見的突變且為大腸癌的低外顯率變異型。全基因組低甲基化、局部區(qū)域啟動子CpG島過甲基化是大腸癌的表觀遺傳學(xué)特點(diǎn)。甲基化抑制劑逆轉(zhuǎn)該甲基化為治療HNPCC提供了新思路。20%～25%懷疑有MSH2突變但事實(shí)上無該突變的病例可歸因于 EpCAM/TACSTD1生殖細(xì)胞系缺失［21］。Amsterdam和Bethesda的每項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)都不適合鑒別MSH6突變攜帶者，加上25%的MSH6為MSS且主要位于末端結(jié)腸、缺乏結(jié)直癌家族史而易導(dǎo)致漏診。PMS2胚系突變可作為前列腺癌進(jìn)展的重要標(biāo)志，但它在中國HNPCC家系中少見，第2號和第5號外顯子為其 SNP熱點(diǎn)。此外，TGFBR16A和 MicroRNA同HNPCC密切相關(guān)，而BRAF陽性突變幾乎排除了LS。

4 小結(jié)

近幾年發(fā)展起來的新的序列分析技術(shù)DHPLC和HRM有望成為HNPCC較理想的分子篩查方法。雖然HNPCC的發(fā)生同多種易感基因關(guān)系的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但目前還存在許多問題需要進(jìn)行深入的研究。例如是否存在其它的易感基因、如何降低檢測費(fèi)用、如何提高檢測效率、如何合理選擇初篩病例以及如何對易感基因攜帶者進(jìn)行有效的預(yù)防等問題是我們今后努力的方向。

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Hereditary nonpolyposis colorectal cancer genetic susceptibility genes research status

ZHANG Shuying，YU Zhijin，GAN Aihua，XU Angao
1.Department of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524003;2.Huizhou Institude of Medicine，China

Hereditary nonpolyosis colorectal cancer(HNCC)has a close relationship with genetic susceptibility gene mutations.Up to now，the HNPCC genetic susceptible genes are mainly the mismatch repair system related genes such as MLH1，MSH2，MSH6 and PMS2，etc.In addition，a close relationship among miRNA，transforming growth factor receptor and HNPCC has been observed.Single-strand conformation polymorphism(SSCP)is a relative simple method and applied extensively;However，as its multifarious manual operation and the low repeat rate，the results are often vary from person to person and the sensitivity is not high.Denaturing high-performance liquid chromatography(DHPLC)and high resolution melting(HRM)technology are the new sequence analysis technology developed in recent years，which may become the more ideal molecular screening method.

Genetic;Colorectal cancer;Susceptibility

R574.6

A

1006－5709(2012)11－0989－05

2012-06-24

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.11.003

廣東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(S2011010005494)，惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011Y091)

張淑英，碩士研究生。E-mail:jasmine_101@126.com

許岸高，E-mail:angao62@21cn.com

專題·胃癌·大腸癌·肝癌