陽 翠，張曉崗，楊玉蓉，劉 萍

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

苦豆子(Sophoraalopecuroides)系豆科槐屬植物，別名為苦豆根、苦豆草、苦干草，是我國西北干旱、荒漠地區(qū)廣泛分布的一種多年生草本植物[1]。由于苦豆子耐旱、耐寒、耐鹽堿，在荒漠和沙性土壤上具有極強(qiáng)的生命力，在黃河兩岸常栽培以固定沙土，是北方地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)中重要的生態(tài)草[2]。其植株和種子富含多種生物堿、黃酮類物質(zhì)、有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)和多糖類等，具有抗癌、免疫等藥理活性[3]。目前，關(guān)于苦豆子的研究多集中在生物特性、化學(xué)成分、藥理作用和臨床研究等方面[4-6]，而關(guān)于其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性方面的研究相對較少。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)是以PCR為基礎(chǔ)的簡單、快速的分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)靈敏度高、操作簡單、實(shí)驗(yàn)材料需要量少且要求不高、不需要放射性標(biāo)記，適用于對種群的遺傳背景了解不多或根本不了解的物種，是植物DNA水平上遺傳多樣性的直接反映。RAPD分子標(biāo)記技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系研究、遺傳圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性評價(jià)等領(lǐng)域[7-10]。本研究采用RAPD標(biāo)記技術(shù)，對22個(gè)苦豆子居群進(jìn)行比較分析，旨在從DNA分子水平上探索苦豆子居群間的遺傳多樣性程度，從而為苦豆子種質(zhì)資源的保護(hù)以及引種栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1苦豆子種質(zhì)資源 依據(jù)苦豆子的地理分布特點(diǎn)，分別采集來自寧夏、甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙古5個(gè)省份22個(gè)居群的苦豆子種子作為供試材料，其中寧夏居群14個(gè)，其他省份的居群8個(gè)。在采集材料的同時(shí)進(jìn)行生態(tài)環(huán)境的調(diào)查[6]，所有種子均于2007、2008年收集，保存于-70 ℃的超低溫冰箱中備用。居群編號、來源以及采集地的生態(tài)環(huán)境和伴生種如表1所示。

1.1.2試劑與儀器設(shè)備 用于RAPD反應(yīng)的dNTP、Taq酶、Mg2+購自生工(上海)生物工程有限公司；引物由北京奧科生物公司合成；PTC-200型PCR循環(huán)儀購自美國伯樂公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCP-31F型電泳槽、UV-VIA型紫外反射透射儀均購自北京六一儀器廠；Gilson微量移液器。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 采用改良的CTAB法提取基因組DNA[11]。

1.2.2RAPD的反應(yīng)程序和體系 RAPD擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性120 s；94 ℃變性 20 s，36 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，39個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10min，擴(kuò)增產(chǎn)物在0.5×TBE、電壓4～5 V·cm-1、2.0%瓊脂糖凝膠(含50 μg·mL-1溴化乙錠)中電泳，在紫外反射透射儀下觀察并用數(shù)碼相機(jī)拍照。RAPD擴(kuò)增反應(yīng)體系經(jīng)過比較和優(yōu)化確定為20 μL，具體如下：10×PCR buffer 2 μL，MgCl25 mmol·L-1，引物20 μmol·L-1，模板DNA 20 ng，dNTP 1 mmol·L-1，TaqDNA聚合酶1 U·μL-1，ddH2O 12.5 μL。

表1 供試苦豆子種質(zhì)資源編號、來源及生境調(diào)查Table 1 Germplasm resources and habitat characteristics of Sophora alopecuroides

1.2.3引物篩選 以103、106居群DNA為模板對300條RAPD隨機(jī)引物逐一進(jìn)行篩選。記錄條帶清晰、有多態(tài)性的引物編號，將該引物再重復(fù)一次，驗(yàn)證其可靠性，如果能夠清晰、穩(wěn)定重復(fù)出現(xiàn)多態(tài)性，記錄引物編號，以備用于22個(gè)居群的遺傳多態(tài)性分析。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果按帶的有(記為1)無(記為0)建立二元數(shù)據(jù)矩陣。通過Popgene 32軟件計(jì)算下列參數(shù)：多態(tài)性位點(diǎn)百分比、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性(H)、Shannon信息指數(shù)(I)、Nei’s遺傳距離(GSij)和遺傳相似性(GDij)。

GSij=2Nij/(Ni+Nj)；GDij=1-GSij.

式中，Nij為2個(gè)居群i和j共有的條帶數(shù)，Ni、Nj分別為第i個(gè)居群和第j個(gè)居群各自的條帶數(shù)[12]。

用NTSYS 2.1軟件并根據(jù)Nei’s遺傳距離用非加權(quán)配對類平均法(Unweight pair-group method with arithmetic means，UPGMA)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建各居群之間親緣關(guān)系樹狀圖；用DCENTER程序進(jìn)行遺傳距離矩陣轉(zhuǎn)換，并用EIGEN程序求特征值和特征向量進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis，PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1RAPD擴(kuò)增結(jié)果 從300條RAPD隨機(jī)引物中篩選出31條帶型清晰、多態(tài)性好的引物，對22個(gè)苦豆子居群的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。所有樣品均得到分子量在250～2 000 bp范圍內(nèi)的條帶(圖1)。每個(gè)引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)為5～18個(gè)，共擴(kuò)增出314個(gè)位點(diǎn)，平均每個(gè)引物的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)為10.13，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為285個(gè)，多態(tài)性比率高達(dá)90.76%，多態(tài)位點(diǎn)百分率在60%～100%(表2)，說明所研究的22個(gè)居群苦豆子在DNA水平上遺傳多樣性較高。不同引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)不同，同一引物對不同居群苦豆子擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)也不一樣，充分體現(xiàn)出不同苦豆子基因組DNA的多態(tài)性，也表明苦豆子居群間存在遺傳差異。

2.2基于RAPD標(biāo)記的遺傳多樣性聚類分析 為確定各苦豆子居群間的遺傳關(guān)系，通過Pop-gene 32軟件分析RAPD標(biāo)記的(0，1)矩陣二元數(shù)據(jù)，計(jì)算出苦豆子居群水平上的Na、Ne、H、I分別為1.898 4、1.492 7、0.301 5和0.453 1，表明22個(gè)苦豆子居群間有一定的遺傳分化。

圖1 引物09M27519(A)和09M27532(B)對22個(gè)苦豆子居群的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplified result of primer 09M27519(A) and 09M27532(B) in 22 populations of S.alopecuroides

表2 苦豆子居群遺傳分析的RAPD引物及其擴(kuò)增結(jié)果Table 2 The sequence of RAPD primers and polymorphic efficiency in 22 populations of S.alopecuroides

22個(gè)苦豆子居群間的遺傳距離在0.114～0.709，平均為0.369。其中居群124與居群127的親緣關(guān)系最近，遺傳距離為0.114；而居群105與居群125的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳距離為0.709(表3)。對22個(gè)苦豆子居群的遺傳距離進(jìn)行配對分析，發(fā)現(xiàn)居群105的平均遺傳距離在22個(gè)居群中最大為0.527，表明居群105與其他21個(gè)居群的遺傳差異最大。

表3 22個(gè)苦豆子居群遺傳距離的配對分析Table 3 Pairwise analysis of Genetic distance among 22 populations of S.alopecuroides

UPGMA聚類結(jié)果顯示在遺傳距離0.278處可將22個(gè)苦豆子居群聚為六大類(圖2)。

第Ⅰ類和第IV類均各由一個(gè)居群(105和106)單獨(dú)聚為一類；第Ⅱ類全部由寧夏以外的居群組成，包括居群122、124、125、126和127；第Ⅲ類由4個(gè)寧夏居群組成，包括居群103、104、109和112，這一大類又分為2個(gè)亞類，居群103與居群104聚為一亞類；居群109與居群112聚為另一亞類；第V類由來自寧夏的居群114、115、116與來自青海的居群121、內(nèi)蒙的居群123、新疆的居群128組成；第VI類：由5個(gè)寧夏居群組成，包括居群101、102、110、107和108。聚類結(jié)果顯示，居群105和居群106 與其他20個(gè)苦豆子居群在DNA水平上有較大差異。

圖2 22個(gè)苦豆子居群的UPGMA聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 22 populations of S.alopecuroides

2.3基于RAPD標(biāo)記的主成分(PCA)分析 對RAPD標(biāo)記的數(shù)據(jù)進(jìn)行PAC分析的結(jié)果顯示，第1主成分解釋的變異為43.70%，第2主成分解釋的變異為20.41%，第3主成分解釋的變異為9.62%，3個(gè)主成分綜合解釋的變異為73.73%，能夠反映苦豆子居群間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。將第1、2主成分結(jié)合起來分析可將22個(gè)苦豆子居群分為六大類群(圖3)，主成分分析結(jié)果與UPGMA聚類結(jié)果一致?？梢?，地理分布上的遠(yuǎn)近與苦豆子居群間遺傳上的差異沒有必然聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，各居群所處的生態(tài)環(huán)境、海拔高度、經(jīng)緯度以及伴生種各不相同(表1)，居群間的遺傳差異可能與其所處的微環(huán)境的異質(zhì)性所造成的變異有關(guān)。

圖3 22個(gè)苦豆子居群RAPD標(biāo)記的二維主坐標(biāo)圖Fig.3 The principal coordinate graph of RAPD among 22 populations of S.alopecuroides

3 討論

植物的遺傳多樣性水平與其生物學(xué)特性、生境以及起源進(jìn)化密不可分，其中繁育系統(tǒng)、分布范圍、生活型以及花粉和種子傳播方式對其影響最大[13]。本研究表明，野生苦豆子居群的多態(tài)率為90.79%，Nei’s基因多樣性(H)、Shannon多樣性指數(shù)(I)分別為0.301 5和0.453 1，苦豆子居群間具有較高的遺傳多樣性。

遺傳變異的作用主要是由選擇、突變和基因流動等因素產(chǎn)生，空間距離并不一定能夠產(chǎn)生遺傳變異，彼此相距很近的群體即使存在頻繁的基因流動，在強(qiáng)有力的選擇作用下也可能使得群體間產(chǎn)生遺傳上的變異和分化[13]。22個(gè)苦豆子居群的主成分分析與UPGMA聚類分析的結(jié)果均顯示來自寧夏的14個(gè)居群分別被劃分在了5個(gè)不同類群中，就連來自寧夏鹽池縣的5個(gè)居群(101、104、105、112、114)也分別聚在了4個(gè)不同的類群中，而來自甘肅(124)、內(nèi)蒙(122)、新疆(125～127)的居群卻被歸為一類，各居群間出現(xiàn)了一定程度的遺傳分化，地理分布上的遠(yuǎn)近與居群間遺傳上的差異沒有必然聯(lián)系。這一結(jié)果與陳小勇和宋永昌[14]對黃山西部青岡(Cyclobalanopsisglauca)種群小地理范圍的遺傳分化研究及劉萍等[15]對胡盧巴(Trigonellafoenum-graecum)遺傳多樣性的研究結(jié)果基本一致?？喽棺又饕M(jìn)行無性繁殖兼種子繁殖[16]，種群間基因交流相對較少，不同居群間的遺傳差異可能與其所處的小生境的異質(zhì)性所造成的變異有關(guān)，強(qiáng)有力的環(huán)境選擇有可能導(dǎo)致居群間產(chǎn)生遺傳變異和遺傳分化。

苦豆子居群間的差異與環(huán)境因素有關(guān)，但更大程度上由其遺傳因素決定，RAPD分析結(jié)果證明了這一點(diǎn)。研究苦豆子不同地理種源間的遺傳差異，對苦豆子精細(xì)成分的提取、利用、科學(xué)合理的馴化和栽培有一定的意義。

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