吳建慧，崔艷桃，趙倩竹

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

委陵菜屬(Potentilla)植物是薔薇科一年生或多年生植物，花色艷麗、枝條鞣韌、株型美觀，具有一定的觀賞價(jià)值，并且具有較強(qiáng)的抗旱、抗寒性，容易栽培和管理，生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng)，是退化草地或次生演替地的先鋒物種之一[1]。近年來(lái)，委陵菜屬植物因其具有自然性、原生性、抗逆性強(qiáng)、可粗放管理等特點(diǎn)[2]，在城市的環(huán)境綠化和美化中開始廣泛應(yīng)用。

水分是影響植物生長(zhǎng)、發(fā)育和分布的主要環(huán)境因子之一，所以干旱對(duì)植物的危害程度在諸多非生物脅迫中占首位。植物的耐旱性是指植物通過(guò)一定的抗旱方式在長(zhǎng)期干旱脅迫下的生存能力[3]，對(duì)干旱脅迫條件下植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特性以及遺傳規(guī)律的研究表明，干旱脅迫會(huì)降低植物的光合作用、破壞呼吸鏈、降低碳代謝途徑中一些酶的活性，也會(huì)改變植物組織器官的超微結(jié)構(gòu)[4]。目前，對(duì)委陵菜屬植物的研究主要集中在園林應(yīng)用價(jià)值[5]、引種馴化[6]、花粉形態(tài)[7]以及藥用價(jià)值[8]等方面，耐旱性[9]的研究相對(duì)較少，多見于絹毛委陵菜(P.sericea)、鵝絨委陵菜(P.anserina)等。本研究以委陵菜(P.chinensis)、翻白委陵菜(P.discolor)、白葉委陵菜(P.leucophylla)、輪葉委陵菜(P.verticillaris)為試驗(yàn)材料，在干旱脅迫條件下，比較葉肉細(xì)胞中葉綠體、線粒體等超微結(jié)構(gòu)的變化，以期從細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)方面來(lái)了解其耐旱機(jī)制并比較不同委陵菜屬植物的耐旱能力，為耐旱品種的篩選與培育提供理論依據(jù)，也為干旱地區(qū)綠化建設(shè)的植物選材提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料為4種野生委陵菜屬植物，分別是委陵菜、翻白委陵菜、白葉委陵菜、輪葉委陵菜。2010年8月在大慶草原采集野生種子，2011年3月播種，將幼苗移栽至直徑為9 cm的小盆里，統(tǒng)一管理。

2011年7月選取生長(zhǎng)一致、發(fā)育正常的植株，提供充足的陽(yáng)光、水分和營(yíng)養(yǎng)，保證其正常生長(zhǎng)。開始脅迫試驗(yàn)后停止供水，使其自然失水，以土壤含水量作為干旱脅迫梯度的標(biāo)準(zhǔn)，土壤含水量為35%～40%是正常狀態(tài)、25%～30%是輕度干旱脅迫、15%～20%是中度干旱脅迫、5%～10%是重度干旱脅迫，用稱重法補(bǔ)充水分以維持土壤含水量，直至脅迫結(jié)束，每組處理重復(fù)3次。

樣品的制備：在葉片中脈附近切取1 mm×1 mm的材料，用3%戊二醛固定24 h以上，磷酸緩沖液(pH值為7.2)漂洗3次，每次約20 min，然后在4 ℃條件下用1%鋨酸固定4 h，用去離子水漂洗3次，每次20 min，再用乙醇系列進(jìn)行脫水，丙酮過(guò)渡，隨后用環(huán)氧樹脂812滲透包埋，LKB5切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染，用H7650透射電鏡進(jìn)行觀察，隨機(jī)選擇含有葉肉細(xì)胞的不同視野照相。

每個(gè)處理隨機(jī)選取10個(gè)視野，測(cè)量葉綠體大小(以面積表示)，取平均值，重復(fù)3次；每個(gè)處理隨機(jī)觀察10個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)葉綠體的數(shù)量，取平均值，重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1干旱脅迫對(duì)葉肉細(xì)胞的影響 在自然狀態(tài)下，4種委陵菜屬植物的葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本相同(圖1-A,圖1-E,圖1-I,圖1-M)；在輕度脅迫狀態(tài)下，4種委陵菜屬植物的葉肉細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微變化(圖1-B,圖1-F,圖1-J,圖1-N)；在中度脅迫狀態(tài)下，委陵菜和翻白委陵菜質(zhì)壁分離明顯，局部細(xì)胞膜破裂，葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)混亂(圖1-C,圖1-G)，白葉委陵菜和輪葉委陵菜的結(jié)構(gòu)基本完整(圖1-K，圖1-O)；在重度脅迫狀態(tài)下，委陵菜的細(xì)胞膜破裂，內(nèi)含物外流，葉綠體解體(圖1-D)，翻白委陵菜的葉綠體有團(tuán)聚現(xiàn)象出現(xiàn)(圖1-H)，白葉委陵菜和輪葉委陵菜的細(xì)胞膜基本完整，葉綠體結(jié)構(gòu)散亂，白葉委陵菜葉綠體被膜破裂，有內(nèi)含物外流(圖1-L，圖1-P)。

隨著干旱脅迫程度的加強(qiáng)，葉肉細(xì)胞的受損程度逐漸加強(qiáng)，葉綠體發(fā)生了明顯的變化，受損越來(lái)越嚴(yán)重，而且不同的植物在相同的脅迫條件下葉肉細(xì)胞的受損程度也不同。在相同的干旱條件下，委陵菜的葉肉細(xì)胞受損最重，輪葉委陵菜的葉肉細(xì)胞受損最輕(圖1)。

圖1 干旱脅迫對(duì)4種委陵菜葉肉細(xì)胞的影響Fig.1 Drought stress on the cell of four Potentilla species

2.2干旱脅迫對(duì)葉肉細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)的影響 自然狀態(tài)下4種委陵菜屬植物的葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本相同，沒有明顯差異。細(xì)胞質(zhì)壁結(jié)合緊密，葉綠體數(shù)量多，基粒片層和基質(zhì)類囊體膜結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊，具有少量的嗜鋨顆粒(圖2-A,圖2-E,圖2-I,圖2-M)。

在輕度脅迫時(shí)，細(xì)胞壁稍變厚，葉綠體體積增大，外被膜仍然清晰且基本完整。委陵菜的葉綠體不貼壁分布，葉綠體類囊體片層膨脹明顯，嗜鋨顆粒明顯增多(圖2-B)；翻白委陵菜、白葉委陵菜和輪葉委陵菜的葉綠體及其他細(xì)胞器局部貼壁分布，葉綠體基粒片層輕微扭曲，嗜鋨顆粒數(shù)量變化不明顯(圖2-F,圖2-J,圖2-N)。

在中度脅迫時(shí)，細(xì)胞壁厚度增加，細(xì)胞質(zhì)壁分離明顯，葉綠體拉長(zhǎng)或變成近球狀，嗜鋨顆粒數(shù)量增多，且有大的嗜鋨顆粒出現(xiàn)。委陵菜的葉綠體外被膜局部破裂，基粒和基質(zhì)類囊體膜結(jié)構(gòu)模糊，呈波浪狀，基粒出現(xiàn)膨脹且排列混亂(圖2-C)；翻白委陵菜的葉綠體類囊體片層擴(kuò)張，外膜消失，基粒片層膨脹、溶解或空泡化、破裂，基粒垛疊程度下降(圖2-G)；白葉委陵菜的葉綠體被膜仍然清晰但不完整，局部出現(xiàn)斷裂，基粒和基質(zhì)類囊體膜結(jié)構(gòu)模糊，但仍排列有序(圖2-K)；輪葉委陵菜的葉綠體受損相對(duì)較輕，結(jié)構(gòu)基本完整(圖2-O)。

圖2 干旱脅迫對(duì)4種委陵菜葉肉細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Drought stress on the chloroplast of four Potentilla species

在重度脅迫時(shí)，委陵菜的葉綠體被膜破裂，甚至完全解體，內(nèi)含物外流，片層結(jié)構(gòu)排列紊亂(圖2-D)；翻白委陵菜的葉綠體出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象(圖2-H)；白葉委陵菜的葉綠體被膜破裂，有內(nèi)含物外流(圖2-L)；輪葉委陵菜的葉綠體基粒和基質(zhì)類囊體膜結(jié)構(gòu)呈波浪狀，有較寬的間距出現(xiàn)，基粒出現(xiàn)彎曲以及膨脹(圖2-P)。

在相同的干旱脅迫條件下，委陵菜的葉綠體破損最嚴(yán)重，輪葉委陵菜葉綠體的破損程度相對(duì)較輕。

2.3干旱脅迫對(duì)4種委陵菜屬植物葉綠體大小和數(shù)量的影響 隨著干旱脅迫程度的加強(qiáng)，4種植物的葉綠體大小呈逐漸減小的趨勢(shì)，葉綠體數(shù)量呈逐漸增多的趨勢(shì)(表1，圖1)。委陵菜、翻白委陵菜、白葉委陵菜、輪葉委陵菜葉綠體變化率分別為77.19%、71.22%、70.52%、62.01%。

2.4干旱脅迫對(duì)葉肉細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響 正常條件下委陵菜屬植物葉片細(xì)胞中線粒體多呈較規(guī)則的橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，雙層被膜結(jié)構(gòu)完整，脊較豐富，內(nèi)嵴小而少，細(xì)胞質(zhì)濃(圖3-A,圖3-E,圖3-I,圖3-M)。

表1 干旱脅迫對(duì)4種委陵菜葉綠體大小和數(shù)量的影響Table 1 Effects of drought stress on chloroplast size and number of four Potentilla species

輕度脅迫條件下，線粒體數(shù)量增多，線粒體膨脹，拉長(zhǎng)或變圓，委陵菜的部分線粒體內(nèi)外膜和嵴變模糊，嵴數(shù)量變少(圖3-B)；翻白委陵菜的線粒體結(jié)構(gòu)保持完整，但脊的數(shù)目增加，并略微腫脹(圖3-F)；白葉委陵菜的線粒體外膜受到破壞，內(nèi)部無(wú)明顯變化(圖3-J)；輪葉委陵菜的線粒體結(jié)構(gòu)保持完整，沒有明顯變化(圖3-N)。

中度脅迫條件下，委陵菜的線粒體外膜出現(xiàn)降解現(xiàn)象，內(nèi)部脊變少(圖3-C)；翻白委陵菜的線粒體局部外膜破裂(圖3-G)；白葉委陵菜的部分線粒體內(nèi)外膜和嵴變模糊，嵴數(shù)量變少，細(xì)胞質(zhì)變淺(圖3-K)；輪葉委陵菜的線粒體外膜清楚，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊不清(圖3-O)。

重度脅迫條件下，委陵菜的線粒體開始降解，內(nèi)含物流出(圖3-D)；翻白委陵菜的線粒體內(nèi)外膜破裂，嵴消失，線粒體出現(xiàn)空泡化(圖3-H)；白葉委陵菜的線粒體內(nèi)外膜膨大或破裂，內(nèi)含物流出(圖3-L)；輪葉委陵菜線粒體外膜清楚，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊不清(圖3-P)。

圖3 干旱脅迫對(duì)輪葉委陵菜葉肉細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Drought stress on the mitochondria of four Potentilla species

在相同的干旱脅迫條件下，委陵菜的線粒體被破壞得最嚴(yán)重，輪葉委陵菜的線粒體損壞程度相對(duì)最輕。

3 討論

植物暴露在自然環(huán)境中最多的是葉片，葉片對(duì)外界環(huán)境的變化很敏感，也比較容易適應(yīng)環(huán)境，因而形態(tài)和結(jié)構(gòu)易隨環(huán)境改變[10-12]。葉肉細(xì)胞中葉綠體和線粒體是植物光合作用、能量流動(dòng)的細(xì)胞器，也是對(duì)環(huán)境反應(yīng)很敏感的細(xì)胞器[13]。因此，在干旱脅迫條件下，比較觀察4種委陵菜屬植物的葉綠體、線粒體等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，是判斷其耐旱能力的方法之一。

在葉肉細(xì)胞中，葉綠體和線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小、數(shù)目和分布常因植物所處的環(huán)境條件不同而發(fā)生相應(yīng)變化[14]，尤其在逆境脅迫下其結(jié)構(gòu)和生理功能的變化更為顯著[15]。本試驗(yàn)中，在輕度脅迫下，4種植物葉肉細(xì)胞均輕微受損，區(qū)別不太明顯；在中度脅迫下，委陵菜和翻白委陵菜的葉肉細(xì)胞受損程度相對(duì)較重，白葉委陵菜和輪葉委陵菜的受損程度相對(duì)較輕；在重度脅迫時(shí)，委陵菜的葉肉細(xì)胞被破壞的最嚴(yán)重，輪葉委陵菜的受損程度最輕。說(shuō)明隨著干旱脅迫程度的加強(qiáng)，4種植物葉肉細(xì)胞的受損程度均逐漸加強(qiáng)，而且不同的植物在相同的脅迫條件下葉肉細(xì)胞的受損程度不同。

葉綠體是植物光合作用的場(chǎng)所，對(duì)水分的虧缺較敏感，它的正常與否是判斷植物細(xì)胞活性的一個(gè)重要指標(biāo)[16]。本試驗(yàn)中，在輕度脅迫時(shí)，委陵菜葉綠體受損相對(duì)嚴(yán)重，翻白委陵菜、白葉委陵菜和輪葉委陵菜的葉綠體受損相對(duì)較輕；在中度脅迫時(shí)，白葉委陵菜和輪葉委陵菜的葉綠體受損較輕，翻白委陵菜和委陵菜的葉綠體受損相對(duì)較重；在重度脅迫時(shí)，葉綠體受損程度為輪葉委陵菜<白葉委陵菜<翻白委陵菜<委陵菜，而且委陵菜、翻白委陵菜、白葉委陵菜和輪葉委陵菜4種植物的葉綠體的變化率分別為77.19%、71.22%、70.52%和62.01%，呈逐漸減小的趨勢(shì)，說(shuō)明隨著干旱脅迫程度的增加，葉綠體的受損越嚴(yán)重，且不同植物的葉綠體對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)不同，因此在干旱脅迫中葉綠體的受損程度可以作為判斷植物耐旱性強(qiáng)弱的依據(jù)之一。陳建輝等[17]研究表明，葉綠體結(jié)構(gòu)的變化可以作為評(píng)價(jià)大麥(Hordeumsativum)耐旱性強(qiáng)弱的形態(tài)結(jié)構(gòu)指標(biāo)。郁慧等[18]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下不同植物的葉綠體結(jié)構(gòu)的受損程度與其抗旱性強(qiáng)弱相對(duì)應(yīng)。鄭敏娜等[19]研究指出，水分脅迫下6種牧草葉肉細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)的受損程度與各牧草抗旱性強(qiáng)弱相對(duì)應(yīng)。本研究中，干旱脅迫條件下，耐旱性強(qiáng)的葉綠體受損較輕，耐旱性弱的葉綠體受損較重，此結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致。

線粒體是動(dòng)力工廠，是進(jìn)行呼吸作用的主要場(chǎng)所，為植物的生命活動(dòng)提供能量。細(xì)胞中線粒體的數(shù)目，以及線粒體中嵴的多少，與細(xì)胞的生理狀態(tài)有關(guān)。當(dāng)代謝旺盛、能量消耗多時(shí)，細(xì)胞就具有較多的線粒體，其內(nèi)有較密的嵴；反之，代謝較弱的細(xì)胞，線粒體較少，內(nèi)部嵴也較疏。當(dāng)植物受到干旱脅迫時(shí)，線粒體膜的破壞、嵴的減少甚至消失必將影響到葉綠素合成、貯藏及光合作用的主要器官。本試驗(yàn)中，在輕度脅迫時(shí)，委陵菜的線粒體受損相對(duì)嚴(yán)重，其他3種植物的線粒體損壞不明顯；在中度脅迫時(shí)，白葉委陵菜和輪葉委陵菜的線粒體受損較輕，委陵菜最嚴(yán)重；在重度脅迫時(shí)，委陵菜的線粒體被破壞得最嚴(yán)重，輪葉委陵菜的線粒體損壞程度相對(duì)最輕。說(shuō)明隨著干旱脅迫程度的增加，線粒體的受損越嚴(yán)重，且不同植物的線粒體對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)不同，但是線粒體結(jié)構(gòu)的變化與葉綠體相比，表現(xiàn)較為遲鈍。陳燕等[20]研究表明，線粒體結(jié)構(gòu)的變化比葉綠體略遲鈍，但隨著葉綠體的傷害加重，線粒體脊也迅速斷裂、解體并空泡化而喪失功能。黑麥草(Loliumperenne)[21]和絹毛委陵菜[22]線粒體對(duì)干旱脅迫的耐受力要比葉綠體的強(qiáng)，且不同植物的線粒體結(jié)構(gòu)受損程度與其抗旱性強(qiáng)弱相對(duì)應(yīng)。本研究中，干旱脅迫條件下，耐旱性強(qiáng)的委陵菜屬植物的線粒體受損害較輕，耐旱性弱的線粒體受損害較重，此結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致。

綜上所述，通過(guò)對(duì)4種委陵菜屬植物葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，在同一干旱脅迫條件下，不同植物的葉肉細(xì)胞受損程度不同，而且隨著干旱脅迫的加強(qiáng)，植物葉肉細(xì)胞受損越嚴(yán)重。依據(jù)植物在干旱脅迫時(shí)發(fā)生的變化和試驗(yàn)結(jié)果的分析表明，4種委陵菜屬植物耐旱能力的大小依次為：輪葉委陵菜>白葉委陵菜>翻白委陵菜>委陵菜。

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