許會(huì)芬，羅軍，李芳，余康，石恒波，李君，林先滋，朱江江

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 (Sterol regulatory element binding protein，SREBPs) 是體內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于 bHLH-Zip (Basic helixloop-helix leucine zipper) 核轉(zhuǎn)錄因子超家族的一員，與體內(nèi)膽固醇及脂肪生成基因的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，SREBPs可以直接激活膽固醇、脂肪酸、甘油三酯及磷脂生物合成及攝取過(guò)程中 30多個(gè)基因及還原型輔酶Ⅱ (NADPH) 的表達(dá)[2-4]。乳腺作為哺乳動(dòng)物的特有器官，是機(jī)體脂質(zhì)合成的3個(gè)主要部位 (脂肪、肝臟及乳腺)之一[5]。與肝臟、脂肪不同的是，乳腺具有較強(qiáng)的泌乳功能，可以使外源基因在乳腺中表達(dá)后隨乳汁排出體外[6]，是研究基因功能的良好材料。研究表明，SREBP-1基因?qū)Σ溉閯?dòng)物乳腺脂肪酸代謝過(guò)程發(fā)揮重要調(diào)控作用。在小鼠泌乳期內(nèi)，SREBP-1基因的表達(dá)量是干奶期的3~4倍，其靶基因的表達(dá)量也有不同程度的上調(diào)，在泌乳高峰期達(dá)到最高[7]。并且隨著泌乳高峰期的到來(lái)，乳中短中鏈脂肪酸 (C6∶0?C14∶0) 的比例也隨之增大。山羊奶中短中鏈脂肪酸含量高，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而關(guān)于羊奶脂肪酸代謝相關(guān)基因功能的研究較少，因此SREBP-1基因的超表達(dá)研究有助于揭示該基因的功能。

本研究通過(guò)構(gòu)建 SREBP-1基因的重組腺病毒超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞包裝擴(kuò)增出高滴度的腺病毒，并感染乳腺上皮細(xì)胞，研究該基因超表達(dá)后對(duì)脂肪酸代謝相關(guān)基因的影響，為SREBP-1基因的功能研究及奶山羊脂肪酸代謝調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

腺病毒穿梭載體 pAdTrack-CMV及骨架載體 pAdEasy-1均由清華大學(xué)常智杰教授惠贈(zèng)；Primescript?RT Reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、LA Taq DNA聚合酶、dNTPs (10 mmol/L)、pMD19-T載體、SalⅠ內(nèi)切酶均購(gòu)自于TaKaRa (大連寶生物工程有限公司)；限制性?xún)?nèi)切酶PemⅠ、PacⅠ及NotⅠ均購(gòu)自NEB公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；B型小量質(zhì)粒快速提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰克公司；Escherichia coli Top10、MarkerⅢ、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自北京天根公司；PCR引物由西安沃爾森生物技術(shù)有限公司合成；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；FuGENE HD Transfection Reagent購(gòu)自羅氏 (Roche) 公司；細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶購(gòu)自NUNC公司 (丹麥)；DMEM/F-12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；1640培養(yǎng)基及標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。CFX96型實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 方法

1.2.1 SREBP-1基因的克隆

根據(jù)西農(nóng)薩能羊 SREBP-1基因的序列(GenBank Accession No. JN790254) 設(shè)計(jì)特異性引物，并在上游和下游分別添加SalⅠ及NotⅠ酶切位點(diǎn) (斜體部分)，并添加保護(hù)堿基 (粗體部分)，上、下游引物序列分別為：SREBP1-S (5￠?3￠)：GCGTCGACATGGACGAGCCACCCTTCAACG A; SREBP1-A (5￠?3￠)：TTGCGGCCGCCTAGCT GGAGGTCACAGTGGTC。

以泌乳期乳腺組織 cDNA為模板進(jìn)行SREBP-1基因的克隆。CDS區(qū)的PCR擴(kuò)增體系為：10 μL 2×GC BufferⅠ，0.5 μL dNTPs (10 mmol/L)，上下游引物SREBP1-S (10 μmol/L)、SREBP1-A (10 μmol/L) 各1 μL，1 μL (50 ng) cDNA模板，0.2 μL LA Taq DNA聚合酶 (5 U/μL)，加入ddH2O至總體積20 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；64 ℃退火30 s；72 ℃延伸3.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收純化后連接pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化E. coli Top10，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒送往Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.2 pAdTrack-CMV-SREBP-1穿梭載體的構(gòu)建與鑒定

對(duì)測(cè)序正確的pMD19-T-SREBP-1重組質(zhì)粒及 pAdTrack-CMV穿梭載體質(zhì)粒進(jìn)行 NotⅠ及SalⅠ雙酶切，電泳檢測(cè)并回收，4 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化E. coli Top10，挑取單克隆培養(yǎng)擴(kuò)繁，取4 mL菌液提取質(zhì)粒后進(jìn)行NotⅠ及SalⅠ雙酶切鑒定。陽(yáng)性質(zhì)粒送往Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.3 pAd-SREBP-1重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定

對(duì)酶切鑒定正確的pAdTrack-CMV-SREBP-1質(zhì)粒進(jìn)行PemⅠ線性化，回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架載體pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受態(tài)細(xì)胞。挑取較小菌落培養(yǎng)擴(kuò)繁，取4 mL菌液提取質(zhì)粒并進(jìn)行PacⅠ酶切鑒定，然后用鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli Top10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒送往Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.4 pAd-SREBP-1重組腺病毒的包裝與擴(kuò)增

重組質(zhì)粒用PacⅠ酶切線性化，乙醇沉淀法回收大片段，回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中匯合度約為80%的HEK 293細(xì)胞以進(jìn)行重組腺病毒的包裝。病毒包裝過(guò)程及收毒方法參照王偉等[8]的具體說(shuō)明。病毒原液全部接種到HEK 293細(xì)胞 (生長(zhǎng)匯合度為80%~90%左右)，接種后4 h更換新鮮的培養(yǎng)基，待細(xì)胞完全病變時(shí) (約2~3 d) 收集病毒，按前述方法收集的病毒液即為第二代病毒懸液。用第二代病毒懸液多次感染HEK 293細(xì)胞，大量擴(kuò)增重組腺病毒。

1.2.5 腺病毒滴度的測(cè)定

具體測(cè)定方法參考江千里等[9]關(guān)于批量快速測(cè)定法測(cè)定標(biāo)志基因?yàn)?GFP的重組病毒滴度的研究。

1.2.6 腺病毒感染乳腺上皮細(xì)胞最佳 MOI (Multiplicity of infection) 值的確定

將乳腺上皮細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待匯合度達(dá)到50%左右時(shí)，更換新鮮的培養(yǎng)基每孔2 mL，分別加入100、150、200、250 μL的腺病毒液 (每個(gè)處理重復(fù)3次)。每天更換新鮮培養(yǎng)基，72 h后觀察熒光表達(dá)情況，綠色熒光表達(dá)良好且沒(méi)有對(duì)細(xì)胞造成明顯病變的量確定為最佳接種量，并計(jì)算MOI值。

1.2.7 pAd-SREBP-1腺病毒超表達(dá)效果的檢測(cè)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的F11代乳腺上皮細(xì)胞接種于六孔板中，培養(yǎng)24 h細(xì)胞達(dá)到40%匯合度后接種腺病毒。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理組：pAd-Control (重組過(guò)表達(dá)空載體)感染 48 h組、pAd-Control感染 72 h組、pAd-SREBP-1感染 48 h組及pAd-SREBP-1感染72 h組。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)收集細(xì)胞提取總 RNA，檢測(cè)濃度及純度后反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，將 3個(gè)重復(fù)的cDNA樣品等份混勻后用作 qRT-PCR的模板。SREBP-1及GAPDH基因?qū)崟r(shí)定量引物見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq (2×) Mix 10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物混合物(10 μmol/L) 1.6 μL，加RNase free H2O補(bǔ)足20 μL體系 (每個(gè)處理重復(fù) 3次)。反應(yīng)條件為：95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線。2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)，其中△Ct=CtSREBP1?CtGAPDH；△△Ct=△Ct處理?△CtpAd-Control。

1.2.8 SREBP-1基因過(guò)表達(dá)后對(duì)脂肪酸代謝相關(guān)基因的影響

利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)FASN、SCD、ACC、ATGL、LXRα及PPARγ基因的實(shí)時(shí)定量PCR引物 (表1)。反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及數(shù)據(jù)分析方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 西農(nóng)薩能羊SREBP-1基因的克隆與鑒定

以泌乳期乳腺組織 cDNA為模板擴(kuò)增得到山羊CDS區(qū)序列3 441 bp (圖1)，雙酶切鑒定后測(cè)序結(jié)果與GenBank中收錄的序列一致。表明成功克隆了西農(nóng)薩能羊SREBP-1基因CDS區(qū)。

圖1 山羊SREBP-1基因的克隆Fig. 1 Cloning of goat SREBP-1 gene. M: marker Ⅲ; 1: amplification product of SREBP-1 CDS region; 2: endonuclease analysis of pMD19-T-SREBP-1 vector.

2.2 pAdTrack-CMV-SREBP-1穿梭載體的構(gòu)建與鑒定

NotⅠ及SalⅠ雙酶切pMD19-T-SREBP-1質(zhì)粒及pAdTrack-CMV質(zhì)粒，回收產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)化E. coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，抽提質(zhì)粒后進(jìn)行NotⅠ及SalⅠ雙酶切 (圖2)，電泳檢測(cè)得到約9 000 bp載體條帶及3 450 bp目的基因條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明穿梭載體構(gòu)建成功。

圖2 pAdTrack-CMV-SREBP-1載體的構(gòu)建Fig. 2 Construction of pAdTrack-CMV-SREBP-1 vector. M: λDNA/Hind Ⅲ DNA marker; 1: pAdTrack-CMV-SREBP-1 digested with NotⅠand SalⅠ.

2.3 pAd-SREBP-1重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定

使用 PmeⅠ對(duì)鑒定正確的 pAdTrack-CMVSREBP-1質(zhì)粒進(jìn)行線性化，回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化含有pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，挑取較小菌落進(jìn)行擴(kuò)繁，重組質(zhì)粒用PacⅠ酶切鑒定，結(jié)果顯示：在30 kb及4.5 kb處有兩個(gè)條帶 (圖3)，表明重組腺病毒載體構(gòu)建成功。

2.4 腺病毒的包裝、擴(kuò)增及滴度測(cè)定

取 5 μg重組腺病毒載體用 PacⅠ酶切線性化，乙醇沉淀法回收大片段，回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的匯合度約為80%的HEK 293細(xì)胞以包裝重組腺病毒。轉(zhuǎn)染后注意更換新鮮培養(yǎng)基，并在轉(zhuǎn)染3 d后觀察綠色熒光表達(dá)情況，此后應(yīng)每天跟蹤觀察腺病毒的包裝與增殖過(guò)程。轉(zhuǎn)染約10~12 d后，細(xì)胞即出現(xiàn)明顯的病變反應(yīng)：變圓呈葡萄球狀，并有50%左右的細(xì)胞脫壁，此時(shí)即可收集第一代腺病毒。病毒上清反復(fù)感染HEK 293細(xì)胞3次后，獲得高滴度的腺病毒 (圖4)。采用病毒批量快速測(cè)定法測(cè)定其滴度為109U/mL。

圖3 pAd-SREBP-1重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 3 Identification of pAd-SREBP-1 recombinant plasmid by enzyme digestion. M: λDNA/Hind Ⅲ DNA marker; 1: pAd-SREBP-1 digested with PacⅠ.

圖4 腺病毒的包裝與擴(kuò)增Fig. 4 Adenovirus package and amplification. (A) GFP expression of HEK 293 cell three days after transfection of pAd-SREBP-1 recombinant adenovirus. (B) GFP expression of HEK 293 cell 8 days after transfection of pAd-SREBP-1 recombinant adenovirus. (C) GFP expression of HEK 293 cell 11 days after transfection of pAd-SREBP-1 recombinant adenovirus. (D) GFP expression of HEK 293 cell 48 h after infection of high titer of recombiant adenovirus.

2.5 腺病毒感染乳腺上皮細(xì)胞最佳 MOI (Multiplicity of infection)值的確定

對(duì)乳腺上皮細(xì)胞接種不同劑量的高滴度腺病毒液，以確定最佳感染復(fù)數(shù) (MOI)，72 h后置于倒置熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)最適宜的病毒接種量為100 μL，MOI值為200 (圖5)。

圖5 接種腺病毒72 h后的乳腺上皮細(xì)胞Fig. 5 Goat mammary epithelial cells infected with adenovirus for 72 h.

2.6 乳腺上皮細(xì)胞中SREBP-1的超表達(dá)效果檢測(cè)

在規(guī)定時(shí)間內(nèi)收集腺病毒感染的乳腺上皮細(xì)胞樣品，提取RNA并檢測(cè)濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄后用于qRT-PCR，檢測(cè)SREBP-1基因的超表達(dá)效率。定量結(jié)果表明：與空載體感染組相比，感染重組腺病毒 72 h組的超表達(dá)效果顯著優(yōu)于48 h感染組，感染重組腺病毒的乳腺上皮細(xì)胞在48 h后，SREBP-1基因的mRNA表達(dá)量升高了約15倍，72 h后靶基因的mRNA表達(dá)量顯著升高了30倍 (圖6)。

2.7 SREBP-1基因超表達(dá)后對(duì)脂肪酸代謝相關(guān)基因的影響

使用2.6中收集的RNA樣品進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè) SREBP-1基因超表達(dá)后對(duì)脂肪酸代謝相關(guān)基因的影響。由圖 7可以看出，接種腺病毒(MOI=200) 72 h后，與空載體感染組相比，F(xiàn)ASN及ACC均顯著上調(diào)了約兩倍，PPARγ上調(diào)了1.47倍，LXRα及ATGL表達(dá)量均升高了1.21倍；但是SCD的mRNA水平無(wú)明顯變化。

圖6 SREBP-1基因在山羊乳腺上皮細(xì)胞中的超表達(dá)Fig. 6 Over-expression of SREBP-1 gene in goat mammary epithelial cells. n=3; **P<0.01 compared with pAd-Control group.

圖7 FASN、ACC、LXRα、PPARγ、SCD及ATGL基因?qū)崟r(shí)熒光定量結(jié)果分析Fig. 7 qRT-PCR analysis of FASN, ACC, LXR, PPARγ, SCD and ATGL gene. n=3; *P<0.05 compared with pAd-Control group; **P<0.01 compared with pAd-Control group.

3 討論

使用腺病毒技術(shù)研究基因功能的關(guān)鍵是首先要獲得高滴度的病毒液。在病毒的包裝及擴(kuò)增過(guò)程中，第一代病毒的包裝決定了整個(gè)腺病毒包裝能否成功，細(xì)胞的狀態(tài)、腺病毒基因的轉(zhuǎn)染量及第一次收集病毒的時(shí)間均會(huì)影響病毒包裝的效率。首先，包裝第一代腺病毒時(shí)所選取的細(xì)胞狀態(tài)一定要好，選擇在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行包裝，因?yàn)榈谝淮俨《景b所需時(shí)間較長(zhǎng) (7~10 d左右)，因此選取的細(xì)胞密度不宜過(guò)高，一般選取匯合度約70%左右HEK 293細(xì)胞即可，接種第二代及第三代病毒的細(xì)胞匯合度一般選在80%以上。其次，重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切后釋放出腺病毒基因，向HEK 293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染該腺病毒基因的量應(yīng)不低于4 μg，否則造成第一次收毒時(shí)病毒滴度過(guò)低，再次擴(kuò)增時(shí)不易成功。另外，第一次收病毒的時(shí)間不宜過(guò)早，只要大部分細(xì)胞仍處于貼壁狀態(tài)就應(yīng)繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。收毒過(guò)早會(huì)使病毒滴度偏低，直接影響后續(xù)擴(kuò)繁，收毒過(guò)晚則細(xì)胞破裂，也會(huì)降低病毒滴度。在本研究中，使用收集的高滴度病毒感染乳腺上皮細(xì)胞72 h后，細(xì)胞中SREBP-1的mRNA的表達(dá)量上升了30倍，超表達(dá)效果顯著。

SREBPs家族3個(gè)成員在機(jī)體脂質(zhì)代謝過(guò)程中發(fā)揮不同的功能[10]，研究表明，SREBP-2基因主要參與調(diào)控機(jī)體膽固醇合成相關(guān)基因的表達(dá)，SREBP-1 (主要是 SREBP-1c) 基因主要調(diào)控機(jī)體脂肪酸、磷脂及甘油三酯的生物合成過(guò)程[11]。除了在肝臟、皮下脂肪組織、腎上腺及骨骼肌等組織中具有較高的表達(dá)外[12]，SREBP-1c在泌乳期奶牛的乳腺組織中的表達(dá)量也較高[13]。在奶牛乳腺組織中，SREBP-1基因的表達(dá)水平與乳汁中脂肪酸的種類(lèi)密切相關(guān)[14]。Bécard等[15]利用腺病毒技術(shù)研究SREBP-1c基因過(guò)表達(dá)對(duì)肝臟中葡萄糖代謝相關(guān)基因的影響，結(jié)果表明 SREBP-1c在胰島素調(diào)控的葡萄糖代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，推測(cè)其可能與胰島素抵抗及葡萄糖代謝紊亂引起的一系列疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，為此類(lèi)疾病的治療提供了新的思路。Sekiya等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與肝臟組織及細(xì)胞不同的是，脂肪細(xì)胞中SREBP-1c表達(dá)量的上升并未引起生脂基因的變化。乳腺作為一個(gè)具有極強(qiáng)分泌功能的器官，不僅含有大量的乳腺上皮細(xì)胞，而且含有較多的脂肪組織，因此，乳腺在泌乳期合成脂肪酸的過(guò)程較為復(fù)雜。Brown和Goldstein[2]研究發(fā)現(xiàn)，在大量合成三酰甘油酯 (TAG) 的組織 (如乳腺)中，脂肪酸及膽固醇生物合成過(guò)程中的基因均受到 SREBPs基因家族調(diào)控。另外，Michael等[7]發(fā)現(xiàn)在 SREBP-1基因敲除鼠的乳汁中所含C16∶0脂肪酸的比例顯著低于 (下降約 25%)正常組，表明由于SREBP-1基因功能的缺失，導(dǎo)致脂肪酸從頭合成途徑部分受阻。

脂肪酸的從頭合成過(guò)程共由 25種酶催化，其中，ACC催化乙酰輔酶A形成丙二酰輔酶A，F(xiàn)ASN是催化丙二酰輔酶A形成16碳脂肪酸的關(guān)鍵酶，SCD是催化單不飽和脂肪酸形成的限速酶。研究表明SREBP-1基因可以直接調(diào)控這3種酶的活性[17-18]，進(jìn)而調(diào)控體內(nèi)脂肪酸的生物合成過(guò)程。Bécard等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)SREBP-1c超表達(dá)后FASN的表達(dá)量上升了2.1倍，而在SREBP-1基因敲除鼠中[17]，ACC及SCD的mRNA表達(dá)量分別下降了約2.5倍及10倍，表明SREBP-1可誘導(dǎo)生脂基因的表達(dá)。本研究中腺病毒介導(dǎo)的SREBP-1基因超表達(dá)技術(shù)，使乳腺上皮細(xì)胞中FASN及ACC的表達(dá)量上調(diào)了2倍，與前人研究結(jié)果一致。但是并未引起 SCD基因的表達(dá)量發(fā)生變化，表明活體水平與細(xì)胞水平之間可能存在一定的差異。

LXRα是一種在肝臟組織中高表達(dá)的核受體，固醇及其衍生物可激活該基因的表達(dá)[19]。研究發(fā)現(xiàn)SREBP-1基因啟動(dòng)子上存在LXRα基因的結(jié)合位點(diǎn) (LXRE)，LXRα與LXRE結(jié)合可直接激活SREBP-1基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控生脂基因的表達(dá)。在 LXRα基因敲除的動(dòng)物體內(nèi)，F(xiàn)ASN、ACC及SCD基因的基礎(chǔ)活性均顯著降低[20]。鐘瑜等[21]研究發(fā)現(xiàn) LXRα基因的超表達(dá)導(dǎo)致SREBP-1基因表達(dá)量升高，而PPARγ基因表達(dá)量下降，其機(jī)制是由于LXRα超表達(dá)后，與更多的配體RXR結(jié)合后形成異源二聚體，導(dǎo)致PPARγ無(wú)法與配體RXR結(jié)合，表達(dá)受到抑制。SREBP-1基因?qū)XRα基因有正反饋調(diào)節(jié)作用，SREBP-1基因的超表達(dá)，導(dǎo)致LXRα基因表達(dá)量上升了1.2倍，同時(shí)也引起 PPARγ基因表達(dá)量的上升，但LXRα和PPARγ基因表達(dá)間是否存在確定的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)關(guān)系尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

目前關(guān)于ATGL及PPARγ的研究大多與脂解相關(guān)[22-23]，ATGL主要參與甘油三酯 (TG) 水解過(guò)程的第一步，形成甘油二酯 (DG) 和游離脂肪酸[24]，DG進(jìn)一步水解后為機(jī)體供能。而PPARγ則通過(guò)與 LXRα競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合配體 RXR[25]，使LXRα-SREBP-1通路介導(dǎo)的生脂過(guò)程受到抑制，PPARγ活性增強(qiáng)啟動(dòng)脂解過(guò)程，為機(jī)體供能。使用pAd-SREBP-1病毒液處理乳腺上皮細(xì)胞72 h后，導(dǎo)致SREBP-1基因及其靶基因的表達(dá)量顯著上升，脂肪酸合成過(guò)程加速，導(dǎo)致脂肪沉積增加，脂質(zhì)積累到一定程度后，產(chǎn)物通過(guò)反饋途徑啟動(dòng)脂解過(guò)程[26]，ATGL及PPARγ基因上調(diào)，以維持機(jī)體的代謝平衡。本研究發(fā)現(xiàn) SREBP-1超表達(dá)后，引起PPARγ及ATGL表達(dá)量分別上調(diào)了1.4倍及1.2倍。這一結(jié)果說(shuō)明在乳腺上皮細(xì)胞中，SREBP-1基因的超表達(dá)可能會(huì)引起脂代謝紊亂，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)構(gòu)建西農(nóng)薩能羊 SREBP-1基因的腺病毒超表達(dá)載體，成功獲得了高滴度的腺病毒 (109U/mL)，并且發(fā)現(xiàn)在山羊乳腺上皮細(xì)胞中，SREBP-1基因的超表達(dá)誘導(dǎo)了生脂基因的表達(dá)。推測(cè)SREBP-1基因在山羊泌乳過(guò)程中，尤其是短中鏈脂肪酸的形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)提高山羊奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及脂肪酸代謝調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建均具有重要意義。

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