劉傳省，施一，高福

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 中國(guó)科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049

在合適的條件下，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)包含了三級(jí)結(jié)構(gòu)的所有信息，通常不必借助外力而自行折疊成有生物活性的狀態(tài)[1]。至于蛋白質(zhì)如何從一級(jí)結(jié)構(gòu)中自發(fā)且準(zhǔn)確地折疊成正確的狀態(tài)，有很多觀點(diǎn)。其中Wolynes及其同事提出的能量通道理論[2-3]獲得了較為廣泛認(rèn)同。他認(rèn)為，蛋白質(zhì)的折疊沿能量減少的方向進(jìn)行，直至一個(gè)最低的能量狀態(tài)，也即有生物活性的狀態(tài)。然而在達(dá)到最低能量狀態(tài)的過程中，可能遇到局部最低的能量狀態(tài)。因?yàn)檫@些局部最低的能量狀態(tài)可以使蛋白質(zhì)處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定但又不具生物活性狀態(tài)，它們又被稱為能量陷阱。這是有事實(shí)依據(jù)的，很多生物體內(nèi)蛋白不正確折疊所導(dǎo)致的疾病[4-7]就是這一觀點(diǎn)的佐證。顯然這些不正確的折疊面臨著巨大的選擇壓力。Wolynes認(rèn)為自然選擇會(huì)剔除蛋白折疊中的能量陷阱，使蛋白朝著有生物活性的穩(wěn)定狀態(tài)折疊[8-9]。后來的研究也證明了這一點(diǎn)[10]。于是又產(chǎn)生了另一個(gè)問題：會(huì)不會(huì)有一些不影響蛋白功能的能量陷阱在自然選擇中保留下來？為了回答上述問題，本文對(duì)多肽HLA-A*2402復(fù)合物 (pHLA) 與T細(xì)胞受體 (TCR) 和輔助受體CD8αα的相互作用進(jìn)行了研究。

pHLA在免疫系統(tǒng)中扮演著重要角色，是TCR的配體[11-15]，并且可以和CD8αα結(jié)合[16-17]。由于和免疫識(shí)別密切相關(guān)，pHLA每一點(diǎn)結(jié)構(gòu)的變化都會(huì)面臨巨大的選擇壓力，因而是用于研究與自然選擇相關(guān)的課題的好材料。最早用于研究的pHLA從細(xì)胞表面酶切獲得[18]，自復(fù)性方法獲得有活性pHLA-A2后[19]，酶切方法被摒棄。復(fù)性后的 HLA-A*2402多肽復(fù)合體 (pHLA) 可以與 TCR結(jié)合，通過對(duì)結(jié)合力的比較，可以在一定程度上反映天然狀態(tài)下HLA-A*2402的活性。本文通過研究復(fù)性所得 pHLA-A*2402，發(fā)現(xiàn)它存在兩種不同構(gòu)象。進(jìn)一步研究了這兩種不同構(gòu)象的生物活性，發(fā)現(xiàn)它們并無差別。由此給出結(jié)論：如果在不同的能量陷阱下折疊成的蛋白構(gòu)象在活性上沒有差別，那么它們就不會(huì)被自然選擇區(qū)分，也就有可能同時(shí)被保留下來。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒：HLA-A*2402重組質(zhì)粒[20]，TCRδ鏈重組pET-21a質(zhì)粒，TCRβ鏈重組pET-21a質(zhì)粒，CD8αα重組質(zhì)粒[21]均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

多肽：RYPLYFGWCF 由中科亞光生物技術(shù)有限公司合成。

菌株：大腸桿菌BL21(DE3) 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 包涵體的提取

轉(zhuǎn)化有pET28a-HLA-A*2402質(zhì)粒的大腸桿菌BL21過夜培養(yǎng)后，接種20 mL于2 L LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.4~0.6，加入IPTG至終濃度為1 mol/L，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3~5 h。按常規(guī)收菌 (接下去步驟都在低溫下進(jìn)行)，用 60 mL左右1×PBS懸浮細(xì)菌，超聲裂解 (超聲6 s，間隔12 s，99次，300 W)。12 000 r/min離心30 min，用玻棒將細(xì)菌碎片撥掉，棄上清。用洗滌緩沖液(50 mmol/L Tris (pH 8.0)，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L DTT，0.5% Triton-100) 充分洗滌包涵體3次，12 000 r/min離心30 min，棄上清。用重懸緩沖液 (50 mmol/L Tris (pH 8.0)，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L DTT) 懸浮包涵體，12 000 r/min離心10~20 min，棄上清。按30 mg/mL將包涵體溶解在溶解緩沖液 (6 mol/L Gua-HCl，10% glycerol 50 mmol/L，Tris (pH 8.0)，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L DTT)，4 ℃攪拌溶解，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 pHLA-A*2402復(fù)性

用 5 mL的注射器向 2 L復(fù)性緩沖液(100 mmol/L Tris (pH 8.0), 400 mmol/L L-Arg HCl, 2 mmol/L EDTA, 5 mmol/L GSH，0.5 mmol/L GSSG) 中滴加β2m包涵體3 mL，復(fù)性8 h。取10 mg多肽，用200 μL DMSO溶解，并迅速注入復(fù)性緩沖液中，待完全溶解后，用5 mL的注射器向2 L復(fù)性緩沖液中滴加HLA-A24重鏈包涵體，每次3 mL，每隔約8 h一次，共3次。濃縮，換成20 mmol/L Tris，50 mmol/L NaCl (pH 8.0)緩沖液。將濃縮的蛋白用Hiload Superdex 200層析柱分離。收集復(fù)性的復(fù)合體蛋白，用Resource Q層析柱進(jìn)一步純化。

1.2.3 TCR復(fù)性

TCR復(fù)性采用透析復(fù)性的方法，將約60 mg的δ鏈，60 mg的β鏈包涵體加入到300 mL復(fù)性液 (400 mmol/L Arg-HCl，100 mmol/L Tris，2 mmol/L EDTA，2 mol/L Urea，調(diào)pH到8.5，5 mmol/L GSH，0.5 mmol/L GSSG)，混勻，孵育過夜。然后，放入800 mL的水中，透析24 h。再放入4 L 10 mmol/L Tris (pH 8.5)溶液中透析24 h。濃縮到約40 mL，過Source 15Q層析柱。

1.2.4 表面等離子共振分析 (SPR)

將純化好的pHLA-A*2402溶液換成HEPES緩沖液，并濃縮至150 μmol/L，梯度稀釋成75、37.5、18.8、9.38 μmol/L。取凍存的CD8αα (制備方法見參考文獻(xiàn)[21])，按上述方法稀釋，濃度為7.5、3.75、1.88、0.94 μmol/L。將純化的TCR換成HEPES緩沖液，濃度調(diào)至20 mg/mL，pH調(diào)至4.5。選用CM5芯片，固定TCR，進(jìn)行SPR操作[22-23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pHLA-A*2402復(fù)合體存在兩種不同的構(gòu)象

圖1 pHLA-A*2402復(fù)合體的分離及電荷特征Fig. 1 Charts and pictures of pHLA-A2402. (A) Gel filtration of pHLA-A*2402. (B) Ion exchange of pHLA-A*2402 on column Resource Q, two peaks were eluded as P1 and P2. (C) Gel filtration of P1 and gel electrophoresis. (D) Gel filtration of P2 and gel electrophoresis. (E) Ion exchange of P1 after two months’ storage in 4 ℃. (F) Ion exchange of P2 after two months’ storage in 4 ℃. (G) Ion exchang of the mixture of P1 and P2 after two months storage and data fitting.

HLA-A*2402與β2m在多肽存在的情況下共復(fù)性，形成穩(wěn)定的復(fù)合體。從圖 1A看出，pHLA-A*2402復(fù)性效果很好，聚體峰和β2m峰都很小，說明絕大部分HLA-A*2402重鏈和β2m都參與形成了復(fù)合體。收集分離的復(fù)合體蛋白，進(jìn)行離子交換層析，此時(shí)可以觀察到，有兩個(gè)獨(dú)立的出峰位置。離子交換層析是利用在一定條件下蛋白表面所帶電荷與層析柱中帶相反電荷的離子交換試劑相互作用而對(duì)蛋白進(jìn)行分離的一種方法。在相同溶液中，由于等電點(diǎn)不同蛋白所帶電荷不同，與層析柱的親和力不同，它們會(huì)被不同濃度的鹽溶液洗脫下來。因此，一個(gè)均一的蛋白只有一個(gè)出峰位置。然而，從圖1B看出，pHLA-A*2402復(fù)合體分成兩個(gè)主峰。由此推斷pHLA-A*2402可能存在兩個(gè)等電點(diǎn)，也必然對(duì)應(yīng)兩種不同構(gòu)象，分別標(biāo)記為 P1、P2。將P1、P2兩個(gè)組分的蛋白再次進(jìn)行分子篩層析，兩個(gè)組分出峰位置相同，表明分子量大小相同。SDS-PAGE顯示兩者均是HLA-A*2402，重鏈和β2m以 1∶1比例形成的復(fù)合體，分子量大小無差別 (圖1C和圖1D)。

收集到的P1、P2組分于4 ℃放置2個(gè)月后，再次進(jìn)行離子交換層析，發(fā)現(xiàn)它們的出峰位置沒有改變，表明它們的電荷特征沒有改變 (圖 1E和圖1F)。從圖1G中對(duì)P1和P2的混合峰的曲線擬合可以看出兩者仍然為獨(dú)立的兩個(gè)峰，說明構(gòu)象差異穩(wěn)定存在。

2.2 TCR的復(fù)性與純化

TCR δ鏈和β鏈在大腸桿菌中均以包涵體表達(dá)，通過透析的方法復(fù)性，共復(fù)性的蛋白通過離子交換法分離，出現(xiàn)一個(gè)主峰 (圖2)。分離的蛋白在非還原情況下，由于δ鏈和β鏈之間二硫鍵的存在，使得電泳顯示為一條帶。在還原劑(DTT) 存在的情況下，二硫鍵被打斷，電泳結(jié)果呈清晰的兩條帶，下面一條是δ鏈，上面一條是β鏈。以上結(jié)果表明TCR已經(jīng)成功復(fù)性。

2.3 兩種不同構(gòu)象的pHLA-A*2402復(fù)合體與TCR和CD8具有相同的親和力

圖2 復(fù)性TCR離子交換分離及鑒定Fig. 2 Ion exchange of refolded TCR, non-reducing electrophoresis and reducing electrophoresis

在T細(xì)胞與靶細(xì)胞的相互識(shí)別中，pHLA復(fù)合體與TCR特異的相互作用是關(guān)鍵的一步。在這個(gè)過程中，CD8作為輔助受體參與作用，并與pHLA復(fù)合體和TCR結(jié)合。因此，當(dāng)觀察到pHLA-A*2402復(fù)合體存在兩種構(gòu)象時(shí)，首先要回答的是，這兩種構(gòu)象的蛋白是否都具有與TCR和 CD8結(jié)合的功能？因此，本文利用表面等離子共振技術(shù) (SPR) 檢測(cè)了這兩種構(gòu)象的pHLA-A*2402復(fù)合體與TCR和CD8的親和力。圖3A和圖3B的結(jié)果表明P1和P2與TCR的相互作用基本沒有變化。P1的解離速率 kd為0.01891/s，P2為0.01691/s，相差10%左右，結(jié)合速率ka和解離常數(shù)KD也都在同一個(gè)數(shù)量級(jí)之內(nèi)。圖3C和圖3D的結(jié)果表明P1和 P2在與CD8αα的相互作用基本沒有變化，它們與CD8αα的結(jié)合速率 ka、解離速率 kd和解離常數(shù) KD都在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)。鑒于蛋白濃度測(cè)定的誤差以及儀器本身所允許的誤差范圍，以上這些在同一數(shù)量級(jí)內(nèi)的差異都可以視作無差異。同時(shí)從表1看出，所有的Chi2的值小于Rmax/10，說明用于計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)的 Langmuir模型是可信的。

綜合以上結(jié)果，pHLA-A*2402復(fù)性后至少存在兩種不同的穩(wěn)定狀態(tài)，這兩種狀態(tài)和 TCR及CD8αα相互作用時(shí)沒有差別。

圖3 兩種不同構(gòu)象的pHLA-A*2402與TCR和CD8αα的相互作用Fig. 3 Charts of BIAcoreò. (A) Interaction between P1 and TCR. (B) Interaction between P2 and TCR. (C) Interaction between P1 and CD8αα. (D) Interaction between P1 and CD8αα.

表1 兩種不同構(gòu)象的pHLA-A*2402與TCR和CD8αα親和力Table 1 The affinity between the two conformations of pHLA-A*2402 and TCR, CD8αα

3 討論

根據(jù)蛋白折疊的基本理論，復(fù)性后可以穩(wěn)定存在的蛋白結(jié)構(gòu)基本上反映了蛋白在生理狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，所以用復(fù)性得到的蛋白來研究生理狀態(tài)的蛋白基本上可靠[24]。這是本文的前提，也是所有以復(fù)性蛋白為材料進(jìn)行研究的前提。

多數(shù)情況下相同蛋白的不同結(jié)構(gòu)往往具有不同的功能[25]，本文首次從復(fù)性的角度證明了同一蛋白在不同狀態(tài)具有相同的功能?？梢杂媚芰肯葳搴妥匀贿x擇理論對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行一個(gè)合理的解釋。當(dāng)HLA進(jìn)行折疊時(shí)，同樣面臨著能量陷阱，這就使得HLA具有兩種不同的構(gòu)象，然而由于它們?cè)谏锘钚陨喜]有差別，自然選擇無法對(duì)它們進(jìn)行區(qū)分，于是就在進(jìn)化中保留下來。雖然本文只是對(duì)HLA的折疊進(jìn)行的研究，但是這個(gè)情形可以類似地推廣到所有的蛋白質(zhì)上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)沿著能量降低的方向進(jìn)行折疊時(shí)，有很多卡在能量陷阱之中，形成不具有生物活性的折疊，由于自然選擇的壓力，這些蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)不斷優(yōu)化，直到這些能量陷阱從蛋白質(zhì)折疊的過程中全部剔除。可是當(dāng)?shù)羧肽芰肯葳宓牡鞍踪|(zhì)和“正確”折疊的蛋白質(zhì)在生物活性上不具有差別時(shí)，它們完全可以逃脫自然選擇的壓力而得以保存。這就出現(xiàn)了同一個(gè)蛋白具有多個(gè)穩(wěn)定構(gòu)象，而這些構(gòu)象又具有相同的功能。

上面的結(jié)論在對(duì)能量通道理論佐證和補(bǔ)充的同時(shí)，也為解析蛋白的結(jié)構(gòu)提出了一些新的推測(cè)。當(dāng)一個(gè)蛋白不能正常結(jié)晶，或者結(jié)晶后有部分區(qū)域的解析度不夠高的時(shí)候，也許并不是因?yàn)檫@個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)具有柔性，而是由于它可能同時(shí)具有多個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。

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