唐瑋，李鍵，陳軍，楊晟

中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所 中國科學院合成生物學重點實驗室，上海 200032

通過優(yōu)化啟動子調節(jié)基因轉錄水平，疏通限速步驟，可達到提高目標產物產量的目的[1-2]。但是利用強啟動子并不一定有效，因為一些目的基因的表達產物或中間代謝產物可能對菌體有毒性，從而抑制菌體生長[3-4]，例如有研究表明在大腸桿菌中過表達編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基因pck會給菌體生長帶來負擔[5]；并且因為大多數的生物過程都是由多個基因相互影響的，很難通過調控一個基因得到最優(yōu)化的途徑。利用不同強度的啟動子與不同基因的組合表達可以獲得性狀最優(yōu)的組合[6]。大腸桿菌是常用的異源表達宿主[7]，已有前人通過易錯PCR獲得了不同強度的啟動子可用于途徑優(yōu)化，Alper和Braatsch等人構建了一系列不同強度的組成型啟動子，其中 Alper系列包括強啟動子 Alper PLTetO1和弱啟動子Alper BB等，Alper PLTetO1的啟動子強度是Alper BB的兩倍[8]，Braatsch系列包括強啟動子Braatsch 20和弱啟動子Braatsch 10等，Braatsch 20的啟動子強度是Braatsch 10的兩倍[9]，可以利用這些不同強度的啟動子與途徑中不同的基因進行組合，通過檢測產物獲得最優(yōu)化的菌株。

傳統(tǒng)工業(yè)上利用丙酮丁醇梭菌生產丁醇[10-11]，近年來通過大腸桿菌異源合成丁醇成為研究熱點[12-13]。丁醇合成途徑中相關的有編碼硫解酶的thlA基因、bcs-operon以及醛/醇脫氫酶基因adhE1和adhE2。其中的bcs-operon由基因crt、bcd、etfAB、hbd組成，分別編碼巴豆酸酶、丁酰輔酶 A脫氫酶，負責電子轉移的黃素蛋白亞基，β-羥-丁酰輔酶A脫氫酶。有文獻報道了ter基因編碼的反式-2-烯酰輔酶 A還原酶 (trans-2-enoyl-CoA reductase)，可以通過不可逆的反應為代謝流提供驅動力，替代丙酮丁醇梭菌來源bcd和etfAB可疏通大腸桿菌丁醇合成途徑[14]。本研究用ter基因代替了bcd和etfAB構建了優(yōu)化的bcs-operon (包括 crt、ter和 hbd基因，簡稱operon)。由于大腸桿菌內源的醇脫氫酶能夠用于丁醇的合成[15]，本研究將強啟動子 Alper PLTetO1或弱啟動子 Alper BB，強啟動子Braatsch 20或弱啟動子Braatsch 10分別與 thlA，operon進行組合，用DNA assembler方法[16]快速組裝丁醇合成途徑，獲得最優(yōu)的啟動子組合的大腸桿菌丁醇生產菌株。這種啟動子優(yōu)化方法也可以在其他的途徑優(yōu)化中得到廣泛的應用。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

大腸桿菌Top10，酵母菌株BY4742和質粒pYES2均為本實驗室保藏，pLY15質粒由本實驗室構建和保藏，pMD18-T simple購自TaKaRa公司，啟動子序列由GeneScript公司合成。

1.2 酶和試劑

限制性內切酶購自寶生物公司和Fermentas；質粒DNA小量試劑盒、PCR純化試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自Axygen，酵母質粒提取試劑盒購自索萊寶生物公司；瓊脂購自上海捷倍思生物技術有限公司；其他試劑均為國產或進口分析純。PCR反應使用的耐熱DNA聚合酶為Taq (MBI Fermentas) 或者KOD (Toyobo)。

1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)使用 LB (Luria-Bertani) 培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g溶于1 L蒸餾水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

酵母培養(yǎng)使用 YPD (Yeast extract peptone dextrose) 培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%胰化蛋白胨，2%葡萄糖，如果配成固體的再加2%的瓊脂，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，其中葡萄糖需要單獨滅菌。

酵母轉化子篩選使用基本鹽培養(yǎng)基(SC-ura3)：1) 酵母基本氮源 (Yeast nitrogen base，YNB，無氨基酸或硫酸銨)：0.34 g，硫酸銨：1 g，YNB+硫酸銨溶于50 mL ddH2O中，單獨滅菌。2) 葡萄糖：4 g (溶于100 mL ddH2O中配成40%的溶液，單獨滅菌。3) 瓊脂4 g (溶于48 mL的ddH2O中單獨滅菌)。4) 需要添加的氨基酸配成100×的母液，過濾除菌：12 mg組氨酸(His)，18 mg賴氨酸 (Lys)，60 mg亮氨酸 (Leu)，溶于6 mL的ddH2O中，過濾除菌。在上述物品滅菌后，稍微冷卻一下，將 YNB、硫酸銨和葡萄糖都加入液體瓊脂中，再加入2 mL的過濾除菌的氨基酸混合液，倒板。

TB發(fā)酵培養(yǎng)基 (500 mL)：1) 將下列組分溶解在300 mL ddH2O中：蛋白胨6 g，酵母提取物12 g，甘油2 mL。各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到 60 ℃。2) 將 1.155 g的KH2PO4和 8.215 g K2HPO4溶在足量的 ddH2O 中，使終體積為100 mL。高壓滅菌。3) 將10 g葡萄糖溶于100 mL ddH2O中，將3種溶液混合均勻。

1.4 方法

1.4.1 根據啟動子和基因設計合適的RBS (核糖體結合位點) 序列

利 用 在 線 網 站 (https://salis.psu.edu/ software/forward) 設計最優(yōu)的RBS序列。

1.4.2 設計同源臂引物

利用pLY15 (含有丁醇合成途徑基因thlA以及operon) 質粒和人工合成的啟動子為模板，設計同源臂，引物如表1所示。

1.4.3 制備啟動子片段和丁醇合成途徑的片段

用引物WA-BB-U和WA-BB-TLA-D擴增弱啟動子片段Alper BB-RBS，引物SA-PLTetO1-U和SA-PLTetO1-TLA-D擴增強啟動子片段Alper PLTetO1-RBS，引物WB-10-U和WB-10-CRT-D擴增弱啟動子片段 Braatsch 10-RBS，引物SB20-U 和 SB20-CRT-D 擴增強啟動子片段Braatsch 20-RBS。

用引物TLA-SA-U和TLA-SB-D擴增帶有強啟動子與強啟動子組合的同源臂的 thlA片段(S-thlA-S)，引物TLA-SA-U和TLA-WB-D擴增帶有強啟動子弱啟動子組合的同源臂的 thlA片段 (S-thlA-W)，引物TLA-WA-U和TLA-SB-D擴增帶有弱啟動子強啟動子組合的同源臂的thlA片段 (W-thlA-S)，引物 TLA-WA-U 和TLA-WB-D擴增帶有弱啟動子與弱啟動子組合的同源臂的 thlA片段 (W-thlA-W)，引物CRT-SB-U和HBD-pYES2-D 擴增帶有強啟動子同源臂的 operon 片段 (S-operon)，引物CRT-WB10-U和HBD-pYES2-D擴增帶弱啟動子同源臂的operon片段 (W-operon)，KOD酶擴增，PCR條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，68 ℃延2 min，35個循環(huán)；68 ℃延伸10 min，16 ℃保溫10 min。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in the study

1.4.4 組建不同強度啟動子的丁醇合成途徑

用 EcoRⅠ酶切酵母-大腸桿菌穿梭載體pYES2 (氨芐抗性)，回收線性化載體，回收Alper PLTetO1-RBS、AlperBB-RBS、Braatsch 20-RBS、Braatsch 10-RBS、S-thlA-S，S-thlA-W、W-thlA-S、W-thlA-W、S-operon、W-operon片段，進行不同強度的啟動子和片段的組裝，構建4種不同強度組合的質粒，如表2所示。

1.4.5 轉化酵母BY4742

將構建4種質粒所需的回收片段進行混合，用核酸定量儀進行定量，載體片段約500 ng，其他片段為300 ng，用真空濃縮儀濃縮到4 μL，電轉化酵母菌株BY4742[16]，電擊條件：電壓1.5 kV，電容 25 μF，電阻 200 ?，菌液涂布在SC-ura3的篩選板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~4 d會出現白色的明顯菌落。

1.4.6 質粒PCR驗證

挑取明顯的酵母菌落，用酵母試劑盒提取酵母質粒，進行質粒PCR驗證thlA以及operon片段。

1.4.7 酵母質粒轉化大腸桿菌 Top10以及質粒的酶切驗證

利用化學轉化法轉化構建的質粒到大腸桿菌 Top10中，用質粒提取試劑盒抽提質粒后用Hind Ⅲ進行酶切驗證。

表2 不同強度的啟動子與片段的組合Table 2 Combination of different promoters and fragments

1.4.8 丁醇含量測定

發(fā)酵方法：96孔板深孔發(fā)酵，培養(yǎng)基為TB發(fā)酵培養(yǎng)基，在微好氧、30 ℃的條件下發(fā)酵100 h。

丁醇含量測定條件：取上述樣品清液0.2 mL與0.8 mL內標液混勻，以配置有Grace公司產品ECTM-WAX毛細管色譜柱的安捷倫公司 7890型氣相色譜儀進行測定。進樣量1 mL，分流比25∶1。分析條件為：柱溫85 ℃，氮氣34.5 kPa.，5.5 min后，升溫至150 ℃；氮氣206.85 kPa，保持3 min，氫氣30 mL/min，空氣400 mL/min，尾吹25 mL/min；進樣區(qū)溫度250 ℃，氫火焰檢測區(qū)溫度為300 ℃。

2 結果與分析

2.1 設計最優(yōu)RBS序列

根據啟動子和基因的組合設計最優(yōu)的 RBS序列，結果如表3所示。

2.2 制備片段和線性化載體

擴增啟動子 AlperPLTetO1-RBS、AlperBBRBS、Braatsch 20-RBS、Braatsch 10-RBS和丁醇合成途徑相關基因片段 S-thlA-S、S-thlA-W、W-thlA-S、W-thlA-W、S-operon、W-operon，用EcoRⅠ酶切載體 pYES2，獲得的片段純化后電泳圖譜如圖1所示。

2.3 不同啟動子強度的質粒構建

將純化片段混合濃縮電轉酵母BY4742，用DNA assembler方法組裝不同強弱啟動子組合的質粒pTY02、pTY03、pTY04和pTY05。提取酵母質粒進行質粒PCR，確定質粒的正確性。如圖2和圖3所示，證明thlA和operon片段同時存在于構建的質粒上。

表3 Alper系列和Braatsch系列的啟動子序列以及最優(yōu)RBS序列Table 3 Sequence of promoter and RBS

圖1 利用設計的含有同源臂的引物PCR擴增啟動子和丁醇合成途徑基因Fig. 1 Amplification of promoter and butanol biosynthesis genes with the design of the containing homologous arm primer. 1: Alper PLTetO1-RBS; 2: AlperBB-RBS; 3: S-thlA-S; 4: S-thlA-W; 5: W-thlA-S; 6: W-thlA-W; 7: Braatsch 20-RBS; 8: Braatsch 10-RBS; 9: S-operon; 10: W-operon; 11: linear vector pYES2; M: DNA marker.

2.4 反轉大腸桿菌后質粒Hind Ⅲ酶切驗證

將酵母質粒反轉大腸桿菌Top10后，抽提大腸桿菌質粒用Hind Ⅲ進行酶切驗證。結果見圖4，證明質粒構建正確。

2.5 發(fā)酵丁醇產量測定

挑取驗證正確的大腸桿菌，利用 96孔板發(fā)酵100 h，用氣相色譜測定丁醇產濃度，結果如圖5所示，證明pTY03組合的質粒產丁醇濃度最高，達到28 mg/L，是其他啟動子組合的3~5倍。

圖2 質粒PCR驗證組裝的4種質粒的thlA片段Fig. 2 Identification of thlA fragment by PCR. 1: pTY02; 2: pTY03; 3: pTY04; 4: pTY05; NC: negative control; M: DNA marker.

圖3 質粒PCR驗證組裝的4種質粒的operon片段Fig. 3 Identification of operon fragment by PCR. 1: pTY02; 2: pTY03; 3: pTY04; 4: pTY05; NC: negative control; M: DNA marker.

圖4 Hind Ⅲ酶切驗證丁醇途徑組裝質粒Fig. 4 Identification of butanol way assembly plasmid by enzyme digestion.

圖5 含有 4種組合的質粒的大腸桿菌 Top10發(fā)酵100 h后的丁醇情況Fig. 5 Four different combination plasmids fermentation results by Escherichia coli Top 100 after 100 h. NC: negative control.

3 討論

生物代謝途徑很少由一個基因控制，大多都是通過多個基因的相互作用[17]，所以代謝工程改造需要平衡代謝流以獲得最優(yōu)的效果[18-19]。通過強啟動子提高轉錄水平不一定能獲得最優(yōu)的目標產物的產量，甚至會抑制宿主的生長。而通過不同強度啟動子的精細調控可以更好地平衡多個基因的相互作用，獲得最優(yōu)的結果。本研究利用DNA assembler方法快速組裝了不同強度啟動子組合的丁醇合成途徑。DNA assembler是一種利用酵母的高同源重組效率[20]從而把目的片段一次性在酵母體內進行組裝的方法，耗時短，效率高，避免了傳統(tǒng)的酶連技術所需的酶切連接等步驟，同時解除了酶切位點對操作的限制[21-22]，更加符合合成生物學日益發(fā)展的需要[23]。但是進行組裝的片段不能出現較長的相同序列，以免發(fā)生重組，引起片段缺失。本研究在梭菌天然生產丁醇的途徑基礎上進行改造，利用大腸桿菌啟動子庫，優(yōu)化RBS序列，將thlA基因以及構建的優(yōu)化的 operon基因與不同強度的啟動子進行組合，根據最后的發(fā)酵結果可以看出 pTY03質粒丁醇含量最高，達到28 mg/L，與其他的啟動子組合相比丁醇產量提高了3~5倍。這可能是因為thlA是整個途徑中的第一步，thlA的強轉錄保證了前體的供應充足，而丁醇的產生會給宿主帶來負擔，甚至影響宿主的生長，用弱啟動子轉錄后續(xù)丁醇合成操縱子相對更好地平衡了代謝流，達到最好的效果。另外，由于同一個operon上的3個基因表達強度不一定一致，我們可以通過將operon上的基因進行重排，或者用單順反子的形式進行基因的進一步細化表達。除啟動子優(yōu)化外，還有一些常用于提高異源表達產物量的方法[24]：1) 敲除副產物途徑和競爭途徑的基因，將代謝流盡可能引向目標產物[25]；2) 考慮異源表達的酶之間的相互作用，通過酶的天然選擇來達到提高目標產物的目的[26]；3) 優(yōu)化表達，對表達基因進行密碼子優(yōu)化，修飾SD序列和RBS位點[27]；4) 蛋白質工程方面的改造[28-29]，包括有理設計[30]和無理設計[31]；5) 發(fā)酵工程方面改造，改變發(fā)酵條件和底物等，提高產物產量等。如進一步優(yōu)化大腸桿菌異源生產丁醇途徑，則可考慮通過啟動子優(yōu)化與酶的天然組合、支路途徑敲除、過表達、發(fā)酵條件優(yōu)化[12]等代謝工程手段結合進一步提高丁醇產量。

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