王亞楠，魏愛云，王美艷，衛(wèi)曉彬，張超，單麗偉，范三紅

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100

2 西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西 楊凌 712100

王亞楠, 魏愛云, 王美艷, 等. 核酸酶P1的原核表達(dá)、純化及酶學(xué)特性分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2012, 28(11): 1388?1397.

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核酸酶P1 (Nuclease P1，NP1，EC 3.1.30.1)是一種非特異性的分解單鏈RNA和DNA的核酸酶。1961年日本科學(xué)家Kuninaka等首次從桔青霉Penicillium citrinum T.中分離獲得[1]。NP1是由270個(gè)氨基酸殘基組成的糖蛋白，分子內(nèi)包含兩個(gè)二硫鍵 (Cys72-Cys217和Cys80-Cys85)，分子表面有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn) (Asn92，Asn138，Asn184和Asn197)[2-3]。1991年Volbeda等用X射線衍射法獲得了分辨率為2.8 ?的NP1晶體結(jié)構(gòu)[4]；1998年Romier等獲得了分辨率為1.8 ?的NP1與底物類似物復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)[5]。分析表明，NP1的催化中心處于一個(gè)裂隙中，包含3個(gè)參與催化的鋅離子。催化中心兩側(cè)存在兩個(gè)疏水性口袋樣結(jié)構(gòu)，直接參與單鏈核酸中核苷酸的識別和結(jié)合。其金屬離子結(jié)合區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)同蠟樣芽胞桿菌 Bacillus cereus F.的磷脂酶 C (Phospholipase C，PLC) 非常相似[4]。NP1與米曲霉Aspergillus oryzae C.的Nuclease S1同源，序列一致性為49.3%，它們同屬S1-P1 Nuclease蛋白家族[3-4,6]；pfam數(shù)據(jù)庫中S1-P1 Nuclease家族目前有482個(gè)成員，它們來自240種不同的真菌、植物、原生生物、細(xì)菌和病毒等。

NP1具有磷酸二酯酶和磷酸單酯酶活性[7-9]，能將單鏈的 RNA分解為 5￠-單核苷酸[9]，而 5￠-單核苷酸及其衍生物在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在生物醫(yī)藥方面，5￠-AMP類似物2￠-C-methyladenosine和 7-Deaza-2′-C-methyl-adenosine、5￠-GMP類似物 2￠-C-methyl-guanosine在體外能強(qiáng)烈抑制丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus) RNA的復(fù)制[10]；5￠-CMP可用于制造胞二磷膽堿、CTP、阿糖胞苷、聚肌胞等生化藥物。5￠-單核苷酸衍生的抗病毒和抗癌藥物已成功用于疾病的治療[11-12]。在食品工業(yè)方面，5￠-IMP和5￠-GMP是典型的鮮味成分[13]。添加 5￠-IMP可使食品具有肉類的鮮味，添加5￠-GMP可使食品產(chǎn)生蔬菜、香菇的鮮味。5￠-核苷酸的生產(chǎn)目前主要依賴于酶解法，因而NP1 的需求量日益增加。

NP1在核酸研究中的應(yīng)用也日益廣泛，主要應(yīng)用于：1) 核酸結(jié)構(gòu)研究和堿基組成分析，包括RNA序列分析和tRNA結(jié)構(gòu)分析[14-16]；2) 蛋白純化過程中核酸的去除[17]；3) DNA損傷分析[18-19]。近年來NP1在tRNA依賴的氨基酸生物合成和轉(zhuǎn)酰胺作用[20]、芳香/雜環(huán)致癌物性DNA加合物的分離[21]、UVA照射和補(bǔ)骨脂素引起的DNA鏈間交聯(lián)的定量測定[22]、DNA脫氨基作用研究中2￠-XMP的測定等方面的研究中也發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[23]。

目前工業(yè)和研究領(lǐng)域所使用的 NP1均通過桔青霉P. citrinum發(fā)酵制備，工業(yè)用酶對純度要求較低，而研究用酶需要高純度，需經(jīng)熱變性、超濾、離子交換層析等多步驟純化獲得。本研究采用基因工程手段將人工合成的 NP1基因?qū)氪竽c桿菌，并利用親和純化獲得具有穩(wěn)定酶活性的重組NP1，為研究用高純度NP1的獲得提供了一個(gè)新的來源。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株Turbo、T7 Express、Origami B(DE3) 為本實(shí)驗(yàn)室保存；分泌表達(dá)載體pMAL-p4X、快速連接酶 Quick Ligase、聚合酶Deep Vent DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和 PstⅠ、蛋白酶 Factor Xa、Amylose Resin購自NEB公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；Taq DNA Polymerase購自北京康為世紀(jì)公司；酵母tRNA購自Invitrogen公司；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 NP1基因的合成

依據(jù)GenBank中NP1氨基酸序列 (GenBank Accession No. AAB19975)，設(shè)計(jì)p1~p22共22段寡核苷酸 (表1)，片段p1包含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，相鄰片段之間兩兩部分互補(bǔ)。

采用重疊延伸PCR，通過兩輪擴(kuò)增獲得NP1基因 (圖1)。第一輪PCR過程為：以p2~p7為模板，以p1和p8為引物擴(kuò)增獲得P1片段；以p8~p21為模板，以p7和p22為引物擴(kuò)增獲得P2片段。第二輪PCR過程為：以P1和P2片段為模板，以p1和p22為引物擴(kuò)增獲得NP1 基因。PCR反應(yīng)程序均為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

圖1 NP1基因拼接示意圖Fig. 1 Schematic diagram of splicing process of NP1. Dashed arrows represented primers for fragment P1, P2 and NP1.

1.2.2 pMAL-p4X-NP1載體的構(gòu)建

以重疊延伸PCR獲得的NP1基因片段為模板，以p1、NP1-Pst I-R為引物 (表1) 擴(kuò)增獲得兩側(cè)分別包含EcoRⅠ和PstⅠ切點(diǎn)的NP1片段。PCR產(chǎn)物膠回收后采用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切，目的片段與同樣雙酶切的pMAL-p4X載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli Turbo菌株，挑取單克隆進(jìn)行 PCR和質(zhì)粒酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送生工生物工程 (上海) 有限公司測序確證。

1.2.3 重組NP1酶活力的檢測

將100 μL底物溶液 (50 μL 5 g/L RNA溶液、50 μL 0.03 mol/L pH 5.3醋酸鈉緩沖液 (含10 mmol/L ZnSO4)) 與25 μL酶液混勻，70 ℃ 溫浴15 min，加入250 μL核酸沉淀劑，冰浴20 min后4 ℃、5 000 r/min離心10 min，用雙蒸水將上清液稀釋合適倍數(shù)測定OD260值。以不加酶液的反應(yīng)液作為對照。在上述條件下每分鐘生成的核苷酸量在260 nm處的吸光值差值為1.0時(shí)定義為一個(gè)酶活力單位[24]。

表1 用于NP1基因合成的寡核苷酸序列Table 1 Sequence of oligonucleotides for NP1 gene synthesis

1.2.4 重組蛋白表達(dá)與純化

將重組載體pMAL-p4X-NP1轉(zhuǎn)化TSS-法制備的T7 Express和Origami B(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞[25]。挑選單克隆，分別接種于 LB和胰蛋白胨-磷酸鹽培養(yǎng)基中[26]，28 ℃和20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h后離心收集菌體，超聲波破碎后離心收集上清，定量測定上清的比活力。將誘導(dǎo)溫度設(shè)定為20 ℃，IPTG終濃度設(shè)定為0.5 mmol/L，分析不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn) (2 h、4 h、6 h、8 h、10 h) 酶活性的變化，從而確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。設(shè)定誘導(dǎo)溫度為20 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為8 h，分析不同濃度IPTG (0.25、0.5、0.75、1 mmol/L) 對酶活性的影響，從而確定最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

在確定的最佳條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體后超聲裂解，上清載入 Amylose 柱進(jìn)行親和層析分離，具體步驟參照唐如春等的方法[27]。使用考馬斯亮藍(lán)G250法對純化獲得的融合蛋白進(jìn)行定量，按照 50:1的比例將融合蛋白和蛋白酶Factor Xa混合，4 ℃過夜酶切去除MBP標(biāo)簽。采用15% SDS-PAGE對總蛋白、可溶性蛋白、純化后的融合蛋白及酶切去除MBP標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白進(jìn)行電泳檢測。

1.2.5 重組NP1的熱穩(wěn)定性和離子依賴性檢測

測定重組NP1的熱穩(wěn)定性時(shí)，將重組蛋白分別于55 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃中保溫30 min，殘余酶活力測定參考1.2.3，將最高酶活力設(shè)為100%。

將終濃度為 2.0 mmol/L不同金屬離子(Zn2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+和Ca2+) 與重組蛋白混合，25 ℃保溫30 min 后，殘余酶活力測定參考1.2.3，將不外加金屬離子時(shí)的酶活力設(shè)置為100%。

2 結(jié)果

2.1 NP1的人工合成

采用兩輪重疊延伸PCR拼接獲得NP1基因。第一輪中，重疊延伸擴(kuò)增 p1~p8獲得大小約320 bp 的目標(biāo)片段P1 (圖2中第1泳道)，擴(kuò)增p7~p22獲得大小約620 bp的目標(biāo)片段P2 (圖2中第2泳道)。以片段P1和P2為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增獲得850 bp NP1基因片段 (圖2中第3泳道)，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖2 重疊延伸PCR產(chǎn)物的電泳檢測Fig. 2 Products of overlaping PCR by agarose gel electrophoresis. M: 2-log DNA ladder; 1: amplified fragment P1; 2: amplified fragment P2; 3: amplified fragment NP1.

2.2 pMAL-p4X-NP1載體的構(gòu)建

獲得的NP1片段經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切，然后與同樣雙酶切處理的pMAL-p4X載體連接，獲得重組載體pMAL-p4X-NP1 (圖3A)。重組載體經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切出現(xiàn)了預(yù)期目的片段(圖3B)。在該載體中，NP1上游融合有分泌型麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP) 編碼區(qū)，兩者之間為蛋白酶Factor Xa識別位點(diǎn)編碼序列。

2.3 NP1融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

重組載體轉(zhuǎn)化T7 Express和Origami B(DE3)菌株誘導(dǎo)表達(dá) (28 ℃和20 ℃，IPTG終濃度為0.5 mmol/L)。28 ℃誘導(dǎo)獲得的融合蛋白MBP-NP1未檢測到酶活性；而20 ℃獲得的重組蛋白有活性。溫度為 20 ℃、IPTG終濃度為0.5 mmol/L時(shí)，T7 Express菌株的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為8 h，Origami B(DE3) 菌株的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h (圖4A)。溫度為20 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間分別為8 h和4 h，T7 Express菌株和Origami B(DE3)菌株最佳 IPTG誘導(dǎo)濃度均為 0.75 mmol/L (圖4B)。

圖3 pMAL-p4X-NP1重組載體示意圖及雙酶切鑒定Fig. 3 Schematic diagram and double digestion of recombinant plasmid pMAL-p4X-NP1. (A) Schematic diagram of pMAL-p4X-NP1. (B) Identification of recombinant plasmid pMAL-p4X-NP1 by double digestion. M: 2-log DNA ladder; 1: pMAL-p4X-NP1 digested with EcoRⅠand PstⅠ.

圖4 不同誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度對酶活性的影響Fig. 4 Effect of time and IPTG concentration on the enzymatic activity. (A) Time. (B) IPTG.

2.4 MBP-NP1融合蛋白的純化與酶活測定

將收集的菌體超聲波破碎后離心，上清液用Amylose親和層析柱純化。融合蛋白 MBP-NP1 (分子量約為為71 kDa，其中NP1為29 kDa，MBP為 42 kDa) 在 T7 Express (圖 5A) 和Origami B(DE3) 菌株中 (圖 5B) 都得到表達(dá)，且均以可溶性形式存在；蛋白酶Factor Xa酶切融合蛋白去除MBP標(biāo)簽后獲得NP1。酶活性定量檢測發(fā)現(xiàn)由T7 Express 和Origami B(DE3) 菌株獲得的MBP-NP1融合蛋白具有一定酶活性；酶切去除MBP標(biāo)簽后比活力均有增加，分別為139.20 U/mg和258.13 U/mg (表2)。Ying等通過熱變性、超濾、硫酸銨沉淀、苯基瓊脂糖凝膠層析、離子交換層析和葡聚糖凝膠層析從1 L桔青霉 P. citrinum發(fā)酵液中分離獲得 1.5 mg天然NP1，其比活力為1 264 U/mg[28]。本研究獲得的重組NP1的比活力約為天然NP1的1/5；但由于采用了親和層析，大幅簡化了純化流程，兩種菌株中融合蛋白的純化效率分別可達(dá)9.65 mg/L和6.30 mg/L。

2.5 重組NP1的熱穩(wěn)定性

由圖6可以看出，重組酶在55 ℃~80 ℃范圍內(nèi)保持了較高的殘余酶活力，80 ℃溫浴30 min后保持 90%以上的殘余酶活力。隨著溫度的繼續(xù)升高殘余酶活力明顯下降。因此重組NP1與天然酶類似，在55 ℃~80 ℃范圍內(nèi)具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖5 重組蛋白NP1表達(dá)及純化的SDS-PAGE分析Fig. 5 SPS-PAGE analysis of recombinant protein NP1. (A) Purification of the recombinant protein from T7 Express strain. (B) Purification of the recombinant protein from Origami B(DE3) strain. M: prestained protein marker; 1: un-induced control; 2: total protein induced with IPTG; 3: soluble protein induced with IPTG; 4: recombinant protein purified by amylose column; 5: recombinant protein cleaved by Factor Xa.

表2 重組蛋白和天然NP1的酶活力比較Table 2 Comparison of specific activity of recombinant protein and native NP1

2.6 重組NP1的金屬離子依賴性

已有研究表明不同的金屬離子對天然 NP1有激活或抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2.0 mmol/L Zn2+、Co2+和Fe2+對重組NP1有激活作用，其中Zn2+激活作用最為明顯。2.0 mmol/L Ca2+、Mn2+、Ni2+、Mg2+和 Cu2+對 NP1有不同程度的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最為明顯 (表3)。

3 討論

圖6 重組NP1的熱穩(wěn)定性Fig. 6 Thermal stability of recombinant NP1.

表3 不同金屬離子對NP1活性的影響Table 3 Effect of different metal ions on specific activity

本研究構(gòu)建了 pMAL-p4X-NP1分泌型表達(dá)載體，并利用T7 Express和Origami B(DE3) 菌株，首次實(shí)現(xiàn)了NP1在大腸桿菌內(nèi)的成功表達(dá)和活性測定。酶活性檢測表明Origami B(DE3) 菌株中獲得的重組蛋白的活性高于T7 Express菌株(75.48 U/mg:51.50 U/mg)；利用蛋白酶Factor Xa切除MBP標(biāo)簽后，兩種重組蛋白的活性均有上升，分別為258.13 U/mg和139.20 U/mg。融合蛋白MBP-NP1具有一定的酶活力，但融合在N-端的MBP標(biāo)簽對酶活性產(chǎn)生了一定的影響。我們也曾將His-tag融合在NP1的C-末端，結(jié)果獲得的融合蛋白檢測不到活性，說明NP1的C-末端對酶的活性也非常重要。本研究采用分泌型融合表達(dá)載體pMAL-p4X，MBP的融合增加了目標(biāo)蛋白的可溶性，分泌型表達(dá)則降低了重組蛋白對宿主細(xì)胞的傷害，提高了目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。利用大腸桿菌表達(dá) NP1的研究尚未見報(bào)道，與Ying等建立的桔青霉P. citrinum發(fā)酵和分離純化法相比[28]，本研究獲得的重組 NP1的比活力雖然較低，但表達(dá)量高，純化流程簡單，重組蛋白可達(dá)6.30~9.65 mg/L，且可通過高密度發(fā)酵等手段進(jìn)一步提高表達(dá)效率。

天然NP1的表觀分子量為42~50 kDa，而根據(jù)氨基酸序列推導(dǎo)的理論分子量僅為29 kDa，這是由于天然NP1存在糖基化現(xiàn)象[2,4]。本研究采用了大腸桿菌系統(tǒng)，因而制備的重組NP1不存在糖基化現(xiàn)象。與天然NP1相比，重組NP1的比活力約為前者的20%左右，缺少糖基化修飾可能是造成活力下降的原因之一。重組蛋白在80 ℃溫浴30 min后保持90%的殘余酶活力，90 ℃溫浴30 min后仍有69%的殘余酶活力，說明重組蛋白具有良好的耐熱性，其熱穩(wěn)定性與天然酶相當(dāng)。重組蛋白對金屬離子的依賴性實(shí)驗(yàn)顯示，2.0 mmol/L Zn2+、Co2+、Fe2+對重組蛋白均有不同程度的激活作用，Mn2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+、Cu2+則均有不同程度的抑制作用，其中Zn2+的激活作用最顯著，而Cu2+的抑制作用最明顯[9]，這與Ying等的研究結(jié)果有所不同[28]。

NP1在研究中的應(yīng)用日趨廣泛，而目前商品化NP1主要通過桔青霉P. citrinum發(fā)酵獲得，純化過程繁瑣。本研究實(shí)現(xiàn)了NP1在大腸桿菌系統(tǒng)中的功能性表達(dá)和純化，并證明重組NP1具有較高的比活力和良好的熱穩(wěn)定性，為研究用高純度NP1的獲得提供了一個(gè)新的來源。

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