辛勝男，張可心，張名岳，韓宗璽，邵昱昊，劉曉麗，劉勝旺，馬得瑩

1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，黑龍江 哈爾濱 150030

2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001

近年來(lái)，抗生素濫用所引發(fā)的問(wèn)題日益受到人們的關(guān)注，因此，研究無(wú)污染、無(wú)殘留、無(wú)毒副作用的新型抗菌制劑代替抗生素作為飼料添加劑已成為畜牧業(yè)要解決的首要問(wèn)題?？咕氖巧矬w內(nèi)產(chǎn)生的一類具有廣譜抗菌活性的小分子肽，是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抵抗外源病原體的入侵方面發(fā)揮重要作用[1-3]。因此，開(kāi)展禽 β-防御素研究對(duì)于進(jìn)一步探討禽β-防御素在體內(nèi)、外的作用及其機(jī)理具有重要意義。禽β-防御素 (β-defensin，AvBD) 是一類廣泛存在于禽體內(nèi)的抗菌肽，是禽類先天免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，在機(jī)體局部抗感染與免疫方面發(fā)揮著重要作用，是機(jī)體抵御外界微生物侵襲的第一道化學(xué)屏障，并且具有廣譜抗菌、抗病毒和免疫增強(qiáng)作用，對(duì)機(jī)體無(wú)毒害、無(wú)殘留，因此進(jìn)一步研究禽β-防御素在體內(nèi)、外的作用及其機(jī)理具有重要意義。目前已從雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴕鳥(niǎo)和企鵝等禽類體內(nèi)分離到40余種禽β-防御素，其主要分子特征為含有位置保守的6個(gè)半胱氨酸殘基組成的3對(duì)二硫鍵[4]。大量的研究表明，無(wú)論是人工合成還是天然的禽 β-防御素都具有廣譜的抗菌活性，能夠抑制包括革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、細(xì)菌、真菌等在內(nèi)的大量病原微生物的生長(zhǎng)[5-8]。另外，其他種的一些防御素還具有抗病毒并提高機(jī)體免疫的特性[1,9-12]。禽 β-防御素廣泛分布于機(jī)體各個(gè)組織器官，包括消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)[3,13-15]。目前，有關(guān)鴿子 β-防御素還尚未見(jiàn)到報(bào)道，由于禽β-防御素在禽先天性免疫和獲得性免疫方面均發(fā)揮著重要作用，而骨髓是重要的免疫器官，肝臟又是新陳代謝的重要器官，因此本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法從鴿的骨髓和肝臟組織中分別擴(kuò)增到 2個(gè)新的禽 β-防御素基因，并制備了這兩個(gè)基因的重組蛋白，同時(shí)對(duì)這兩個(gè)重組蛋白的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步分析，為重組禽 β-防御素在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

鴿子3只，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 菌株與載體

大腸桿菌 (BL21) 株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室禽傳染病研究室保存；四聯(lián)球菌 (ATCC 2835)、金黃色葡萄球菌 (ATCC 29213)、沙門氏菌(ATCC 14028)、枯草芽胞桿菌 (ATCC 9193)、奇異變形桿菌 (ATCC 29245)、嗜酸乳桿菌 (ATCC 4356)、綠膿桿菌 (ATCC 9027)、多殺性巴氏桿菌 (ATCC 6529)、雞白痢菌 (C79-11-S11)、豬霍亂沙門氏菌 (CVCC 2140)、兔波氏桿菌 (ATCC 33222) 均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。pMD18-T載體購(gòu)自 TaKaRa公司。pGEX-6p-1載體購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.3 試劑

ExTaq DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、IPTG購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；M-MLV鼠源反轉(zhuǎn)錄酶、RNA提取 TRizol試劑盒均購(gòu)自Invitrogen公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；GST Resin蛋白純化試劑盒購(gòu)自Novagen公司；其他試劑均為分析純。

1.1.4 引物

根據(jù)雞的 AvBD5 (GenBank Accession No. AY534897) 的基因序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)PCR引物分別用于基因克隆與重組蛋白的表達(dá) (表1)。

表1 PCR引物序列與預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 PCR primers and predicted length of product

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

取鴿骨髓、肝臟組織各 0.1 g左右，按照TRizol試劑盒方法提取總RNA，體系為10 μL。

1.2.2 RT-PCR

用DEPC處理過(guò)的蒸餾水10.5 μL將上述提取的RNA溶解，混勻后移入另一0.5 mL DEPC處理過(guò)的Eppendorf (EP) 管中，依次加入Oligo dT 1.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，70 ℃水浴5 min，冰浴2 min；再于反應(yīng)管中加入4 μL 5×第一鏈合成緩沖液、2 μL DTT，37 ℃水浴2 min；再加入0.5 μL M-MLV鼠源反轉(zhuǎn)錄酶混勻，37 ℃水浴2 h，70 ℃水浴10 min，即為cDNA模板。根據(jù) GenBank上提交的雞 AvBD 5基因序列(GenBank Accession No. AY534897) 設(shè)計(jì)一對(duì)引物，即P1/P2。

PCR總反應(yīng)體系為25 μL，按ExTaq DNA聚合酶使用說(shuō)明進(jìn)行。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察結(jié)果。

1.2.3 基因克隆及序列分析

對(duì)大小吻合的目的條帶的 PCR產(chǎn)物按OMEGA凝膠回收試劑盒的步驟進(jìn)行合并回收，連接 pMD 18-T Simple Vector，提取質(zhì)粒并將PCR鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送北京六合華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 禽β-防御素的遺傳進(jìn)化分析

將得到的鴿AvBD 5序列應(yīng)用DNAStar軟件與已知的禽 β-防御素基因及部分哺乳動(dòng)物的 β-防御素基因序列做同源性比較，并采用DNAStar中的Clustal V軟件繪制分子遺傳進(jìn)化樹(shù)，分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、原核表達(dá)及蛋白純化

對(duì)原核表達(dá)載體 pGEX-6p-1和重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，設(shè)計(jì)一對(duì)表達(dá)引物，即P3/P4。

用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切將pMD18-T-AvBD 5亞克隆到表達(dá)載體 pGEX-6p-1上，命名為pGEX-P-AvBD 5，將陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pGEX-AvBD 5轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21，挑取單個(gè)菌落在含有氨芐抗性(Amp) 的 Luria-Bertani (LB) 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD600值達(dá)到0.5時(shí)加入IPTG (終濃度為0.6 mmol/L) 進(jìn)行誘導(dǎo)。分別在2 h、4 h、6 h取菌樣，6 000×g離心5 min，棄上清，向沉淀中加入 80 μL PBS (pH 7.4) 和 80 μL 1×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸10 min后冰浴冷卻，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳 (積層膠濃度為5%，分離膠濃度為12%)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，甲醇-冰乙酸脫色液脫色，用薄層掃描儀進(jìn)行分析以確定重組蛋白表達(dá)量。按照 Novagen蛋白純化試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白純化，并測(cè)定蛋白濃度。

1.2.6 重組鴿AvBD5蛋白抗菌活性及理化性質(zhì)的測(cè)定

采用菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定重組融合蛋白的抗菌活性。將1.1.2中各株細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后用相應(yīng)的培養(yǎng)基稀釋細(xì)菌至2×106CFU/mL，先用無(wú)菌PBS (pH 7.3) 稀釋重組融合蛋白，終濃度分別為10 μg/mL、25 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，各取250 μL分別加入無(wú)菌EP管中，同時(shí)設(shè) PBS為對(duì)照，分別吸取每株細(xì)菌培養(yǎng)物10 μL至管中，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，37 ℃振蕩孵育3 h后，各管分別加 100 μL的低濃度培養(yǎng)基(LB∶PBS為1∶1 000)，繼續(xù)37 ℃振蕩孵育3 h，將各管樣品分別作不同倍數(shù)的稀釋，每個(gè)稀釋度分別取200 μL接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，每管分別作3個(gè)平行，37 ℃培養(yǎng)箱孵育18 h后，觀察并記錄每個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的菌落數(shù)量，取相同稀釋度的 3個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板菌落的平均值作為該稀釋度樣品的菌落數(shù)量。根據(jù)蛋白濃度和稀釋倍數(shù)計(jì)算每管原液中的細(xì)菌數(shù)量，選取最適合的蛋白濃度計(jì)算細(xì)菌存活率并繪制重組蛋白抗菌圖。

1.2.7 不同鹽離子濃度對(duì)重組鴿AvBD5-GST融合蛋白抗菌活性的影響

用滅菌的去離子水調(diào)整氯化鈉 (NaCl) 的濃度，使終濃度分別為50、100、150 mmol/L。然后用上述含不同NaCl濃度的緩沖液稀釋重組鴿 AvBD5-GST蛋白濃度至 100 mg/L，各取250 μL分別加入無(wú)菌離心管中，相應(yīng)NaCl濃度的稀釋液作為陰性對(duì)照，分別向每管加入細(xì)菌培養(yǎng)物10 μL，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，37 ℃振蕩孵育3 h后，各管分別加100 mL相應(yīng)的低濃度培養(yǎng)基，繼續(xù)37 ℃振蕩孵育3 h。方法同1.2.6。

1.2.8 重組鴿AvBD5-GST融合蛋白對(duì)溶血活性的影響

用無(wú)菌PBS (pH 7.4) 將新鮮雞紅細(xì)胞稀釋為2%~3%，用PBS稀釋重組鴿AvBD5-GST融合蛋白，終濃度分別為100、250、500 mg/L，取20 μL分別加入無(wú)菌離心管中，同時(shí)設(shè)PBS為陰性對(duì)照，0.2% Triton X-100為陽(yáng)性對(duì)照，分別向每管加入180 μL稀釋好的紅細(xì)胞。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，37 ℃孵育1 h，1 000×g離心10 min后取上清，用微量分光光度計(jì)測(cè)OD560值并計(jì)算溶血指數(shù)。每個(gè)樣品作3個(gè)平行測(cè)定，取平均值。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析

抗菌活性以下式計(jì)算：細(xì)菌的存活率 (%) =存活細(xì)菌數(shù)/陰性對(duì)照細(xì)菌數(shù)×100%。細(xì)菌的存活率以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤±s) 表示。所得數(shù)據(jù)采用SAS8.0軟件的ANOVA法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴿AvBD5基因的克隆與序列分析

圖1 鴿AvBD 5 RT-PCR產(chǎn)物分析Fig. 1 Analysis of pigeon AvBD5 RT-PCR products. M: DNA marker; 1: bone marrow issues AvBD5 RT-PCR products; 2: liver issues AvBD5 RT-PCR products.

本研究根據(jù)雞AvBD 5的基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，從鴿骨髓和肝臟組織中分別擴(kuò)增到2個(gè)約200 bp的特異性的目的基因片段，與目的基因大小相符 (圖1)。對(duì)目的片段分別進(jìn)行回收后連接到pMD 18-T Simple載體，對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序結(jié)果有兩種，經(jīng)序列分析，基因大小均為201 bp，編碼66個(gè)氨基酸，分子內(nèi)含有禽β-防御素的特征性氨基酸結(jié)構(gòu)，即由6個(gè)位置保守的半胱氨酸殘基組成，分別在分子內(nèi)形成1~5、 2~4、3~6共3對(duì)二硫鍵 (圖2)。氨基酸序列同源性分析表明，這兩個(gè)多肽與鴨AvBD5的同源性最高，分別為 87.9% (骨髓) 和 78.8% (肝臟)；與雞AvBD5的同源性分別為84.8% (骨髓)和75.8% (肝臟)。因此，根據(jù)Lynn等命名法，我們將該基因命名為鴿 AvBD 5α (骨髓) 和鴿AvBD 5β (肝臟)。采用DNAStar軟件中Clustal V方法將鴿 β-防御素 5氨基酸序列與其他的AvBDs的序列進(jìn)行比較，繪制分子遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖3)。

圖2 鴿AvBD 5基因的編碼區(qū)核苷酸序列與推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Alignment of nucleotide and amino acid sequences of pigeon AvBD 5 and the corresponding peptides.

2.2 鴿AvBD 5α、AvBD 5β蛋白表達(dá)和純化

經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的菌體與誘導(dǎo)前的菌體相比，誘導(dǎo)后的菌體有一條明顯的特異條帶，與預(yù)期大小 (32 kDa) 相符。誘導(dǎo)2、4、6 h后，表達(dá)量無(wú)明顯變化，但相比之下誘導(dǎo)4 h左右表達(dá)量相對(duì)較多 (圖4、5)。

2.3 重組鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β的抗菌活性

本研究采用菌落計(jì)數(shù)法，選用4種革蘭氏陽(yáng)性菌和8種革蘭氏陰性菌作為檢測(cè)菌。結(jié)果表明GST標(biāo)簽蛋白幾乎沒(méi)有抗菌活性，而不同濃度重組鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β蛋白對(duì)多殺性巴氏桿菌、綠膿桿菌、四聯(lián)球菌和金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)雞白痢沙門氏菌和兔波氏桿菌的抗菌活性較弱，另外重組鴿AvBD 5α的抗菌活性與重組鴿AvBD 5β無(wú)顯著差異。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?00 mg/L時(shí)抗菌活性最理想，因此我們選擇重組蛋白濃度為100 mg/L時(shí)的抗菌活性數(shù)據(jù)繪制抗菌圖 (圖6)。另外，為了比較不同禽源AvBD 5的抗菌活性高低，我們將雞、鴨、鵝AvBD 5的抗菌活性與鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β的進(jìn)行比較 (圖6) (雞、鴨、鵝AvBD 5的抗菌活性數(shù)據(jù)引自文獻(xiàn)[16-18])。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他禽源AvBD 5相比，鴿的AvBD 5α和AvBD 5β對(duì)金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、綠膿桿菌與兔波士桿菌的抗菌活性較高。對(duì)雞白痢沙門氏菌的抗菌活性較低。

2.4 NaCl濃度對(duì)重組鴿 AvBD 5α和鴿AvBD 5β的抗菌活性的影響

在高濃度NaCl條件下，重組鴿AvBD 5α和鴿 AvBD 5β蛋白對(duì)多殺性巴氏桿菌的抑制作用有降低趨勢(shì)，當(dāng)NaCl濃度為150 mmol/L時(shí)，重組蛋白對(duì)多殺性巴氏桿菌抗菌活性顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)。與其他禽源β-防御素相比差異也不顯著(P＞0.05) (圖7) (雞、鴨、鵝AvBD 5的抗菌活性數(shù)據(jù)引自文獻(xiàn)[16-18])。

圖3 鴿AvBD 5α、AvBD 5β與禽β-防御素及部分哺乳動(dòng)物β-防御素基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 3 Phylogenetic relationships based on the sequence of pigeon-AvBD 5α, AvBD 5β, AvBDs and partial mammalian beta-defensins.

圖4 重組pigeon-AvBD 5α融合蛋白表達(dá)分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of recombinant pigeon-AvBD 5α fusion protein expressed in the E. coli BL21. 1: supertant; 2: inclusion body; 3: purified protein of pigeon AvBD 5α; 4: purified GST; 5: protein marker; 6: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5α without IPTG induction; 7: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5α on 4 h after induction with IPTG; 8: GST protein; 9: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5α on 2 h after induction with IPTG; 10: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5α on 6 h after induction with IPTG.

圖5 重組pigeon-AvBD 5β融合蛋白表達(dá)分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of recombinant pigeon-AvBD 5β fusion protein expressed in the E. coli BL21. 1: supertant; 2: inclusion body; 3: purified protein of pigeon AvBD 5β; 4: purified GST; 5: protein marker; 6: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5β without IPTG induction; 7: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5β on 2 h after induction with IPTG; 8: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5β on 4 h after induction with IPTG; 9: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5β on 6 h after induction with IPTG; 10: GST protein.

圖6 重組雞AvBD5、鴨AvBD5、鵝AvBD5、鴿AvBD 5α、鴿AvBD 5β和GST蛋白的抗菌活性Fig. 6 The antimicrobial activity of recombinant chicken AvBD5, duck AvBD5, goose AvBD5, pigeon AvBD 5α, pigeon AvBD 5β, and GST against bacterial strains. 1: Staphylococcus acreus; 2: Micrococcus tetragenus; 3: Lactobacillus; 4: Bacillus cereus; 5: Salmonella choleraesuis; 6: E. coli; 7: Pseudomonas aeruginosa; 8: Salmonella; 9: Salmonella pullorum; 10: Proteus mirabilis; 11: Pasteurella multocida; 12: Bordetella bronchiseptica.

2.5 重組鴿AvBD 5α與鴿AvBD 5β融合蛋白對(duì)溶血活性的影響

重組鴿AvBD 5α、鴿AvBD 5β融合蛋白對(duì)鴨血紅細(xì)胞的溶血活性極低，與陰性對(duì)照相比差異不顯著 (P＞0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照相比差異極顯著 (P＜0.01)，與其他禽源 β-防御素相比差異也不顯著 (P＞0.05) (圖8) (雞、鴨、鵝AvBD 5的抗菌活性數(shù)據(jù)引自文獻(xiàn)[16-18])。

圖7 鹽離子濃度對(duì)重組雞、鴨、鵝AvBD5及鴿AvBD5α、鴿AvBD5β抗多殺性巴氏桿菌的影響Fig. 7 Effects of salinity on the antibacterial activity of chicken AvBD5, duck AvBD5, goose AvBD5, pigeon AvBD5α, pigeon AvBD5β against P. multocida.

圖8 重組雞、鴨、鵝AvBD5及鴿AvBD5α、鴿AvBD5β蛋白的溶血活性Fig. 8 The hemolysis activity of recombinant chicken AvBD5, goose AvBD5, pigeon AvBD5α, AvBD5β protein.

3 討論

本研究是據(jù) Lynn等[12]已發(fā)表的雞 AvBD 5 (AY534897) 的基因，設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR的方法從鴿的骨髓組織和肝臟組織中分別克隆出2個(gè)禽β-防御素基因。cDNA大小均為201 bp，編碼66個(gè)氨基酸殘基，這兩個(gè)多肽氨基酸同源性為83.3%。分子內(nèi)含有禽β-防御素的特征性氨基酸結(jié)構(gòu)，即由6個(gè)位置保守的半胱氨酸殘基組成，分別在分子內(nèi)形成1~5、2~4、3~6共3對(duì)二硫鍵。將該基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種的 AvBDs氨基酸序列進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，該基因與鴨AvBD 5氨基酸同源性最高，分別為 87.9%和 78.8%。因此，將該基因命名為鴿AvBD 5α (骨髓) 和鴿AvBD 5β (肝臟)。這種基因序列多態(tài)性的存在可能是由于基因組中單核苷酸發(fā)生了變異[14]，但多態(tài)性并未影響基因的結(jié)構(gòu)，發(fā)生堿基突變的基因大小仍為201 bp，編碼66個(gè)氨基酸。

目前蛋白表達(dá)主要有真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng) (大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng))是目前常用的表達(dá)系統(tǒng)之一，但由于抗菌肽分子小，易被蛋白酶降解，對(duì)宿主菌E. coli有很強(qiáng)的殺傷力，因而不能在E. coli中直接表達(dá)。此外，小分子表達(dá)產(chǎn)物分離、純化較困難，而以融合蛋白形式表達(dá)則可克服這些問(wèn)題，融合表達(dá)后再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行裂解純化，會(huì)得到有抗菌活性的表達(dá)產(chǎn)物。融合蛋白在E. coli BL21中是以包涵體的形式存在，這樣不僅能保護(hù)目的蛋白免受蛋白酶降解，也不會(huì)影響宿主菌的生長(zhǎng)[1-2,9]，從而避免了由于抗菌肽對(duì)宿主菌 E. coli較強(qiáng)的殺傷力而不能在 E. coli中直接表達(dá)的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)選擇了GST基因融合表達(dá)系統(tǒng)中的pGEX-6p-1載體對(duì)鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β基因進(jìn)行原核表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，大部分蛋白以不溶的、無(wú)活性的包涵體形式存在。包涵體是大量表達(dá)的重組蛋白形成的致密顆粒，能保護(hù)目的蛋白不受蛋白酶降解，而且不影響宿主菌的生長(zhǎng)，有利于產(chǎn)物的分離，所以包涵體對(duì)于提高重組蛋白的產(chǎn)量和穩(wěn)定性非常重要。由于目的蛋白形成包涵體后不具有生物活性，因此，本試驗(yàn)采用的Novagen公司的Protein Refolding Kit蛋白純化試劑盒是針對(duì)包涵體進(jìn)行溶解、復(fù)性和透析，并可以使二硫鍵正確折疊，從而純化出有活性的目的蛋白。

禽類的防御素是一種新型抗菌活性肽，它是一類富含精氨酸的陽(yáng)離子低分子多肽。在禽的先天性免疫中發(fā)揮著重要的作用[15-16]。防御素的正電荷和雙親結(jié)構(gòu)是抗菌的關(guān)鍵，防御素的殺菌活性與精氨酸的含量有關(guān)，精氨酸含量高的殺菌活性強(qiáng)。大量研究表明，無(wú)論是重組表達(dá)、天然存在或是人工合成的防御素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性、細(xì)菌、真菌、分歧桿菌、霉菌、螺旋體、病毒 (如流感病毒、皰疹病毒、艾滋病病毒)等均具有很強(qiáng)的殺傷活性[1-2,17,19]，具有高效廣譜抗菌作用，無(wú)毒副作用，不會(huì)使病源微生物菌株變異產(chǎn)生抗藥性[5,13,17-19]。目前，對(duì)于禽 β-防御素的抗菌機(jī)制還沒(méi)有統(tǒng)一的說(shuō)法，比較公認(rèn)的說(shuō)法就是形成離子通道,即防御素通過(guò)靜電作用被吸附到細(xì)菌表面，然后將疏水端插入細(xì)菌膜中，從而改變其膜的結(jié)構(gòu)，在菌膜上造成穿孔從而使細(xì)菌裂解死亡[21]。本研究測(cè)定了重組鴿AvBD 5α、重組鴿AvBD 5β和GST蛋白對(duì)12種細(xì)菌的抗菌活性。結(jié)果表明重組鴿AvBD 5α、重組鴿AvBD 5β蛋白對(duì)這4種革蘭氏陽(yáng)性菌和8種革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)的抑制作用，且對(duì)不同菌種的抑制作用強(qiáng)弱也有所不同，推測(cè)可能與防御素本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β的序列都富含大量帶正電荷的氨基酸，鴿AvBD 5α含有8個(gè)帶正電荷的氨基酸 (7個(gè)精氨酸，1個(gè)賴氨酸)，鴿AvBD 5β含有8個(gè)精氨酸。將鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β與其他禽源β-防御素5比較發(fā)現(xiàn)，其所帶正電荷數(shù)無(wú)顯著差異，但鴿 AvBD 5α和鴿AvBD 5β所帶負(fù)電荷氨基酸數(shù)目最少 (1個(gè)天冬氨酸，2個(gè)谷氨酸)，增加了多肽表面的正電荷數(shù)，從而增加了其抗菌活性。但雞AvBD5、鴨AvBD5、鵝 AvBD5對(duì)雞白痢沙門氏菌的抗菌活性要高于鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β，這可能是由于防御素自身結(jié)構(gòu)上的差異導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌的選擇和抗性程度的不同。對(duì)于大部分細(xì)菌來(lái)講，鴿 AvBD 5α的抗菌活性明顯高于鴿AvBD 5β，這可能是由于鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β的DNA序列中一些單核苷酸發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換和顛換，這是最常見(jiàn)的一種變異形式，這種變異形式被稱為單核苷酸多態(tài)性，它們可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平。同時(shí)本研究將該重組蛋白的標(biāo)簽 GST也進(jìn)行了抗菌活性的測(cè)定，結(jié)果表明GST標(biāo)簽不具有抗菌活性，這也更肯定了重組蛋白的抗菌活性[1-2,9,22]。高濃度NaCl對(duì)重組鴿AvBD 5α和重組鴿AvBD 5β的抗菌活性均有一定影響，Tomita等也報(bào)道了其他離子對(duì)防御素抗菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)某些二價(jià)陽(yáng)離子能夠強(qiáng)烈的抑制防御素的抗菌活性，這表明對(duì)抗菌性的影響是由于離子強(qiáng)度而不是特定離子[23-24]。這可能是由于與防御素競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面，從而影響了防御素和細(xì)菌質(zhì)膜的結(jié)合，影響防御素殺菌效力的發(fā)揮，還可能是由于高鹽濃度加速某些白細(xì)胞的凋亡，影響其趨化作用、吞噬作用，影響防御素的產(chǎn)生。此外，重組鴿AvBD 5α和重組鴿AvBD 5β對(duì)紅細(xì)胞溶血活性極低，一般來(lái)說(shuō)，溶血作用與肽分子結(jié)構(gòu)中的疏水殘基含量有關(guān)，疏水殘基含量越高則往往溶血作用也越強(qiáng)[25]。這些研究結(jié)果為今后 AvBDs重組蛋白作為一種高效的肽類抗生素和禽類飼料添加劑等應(yīng)用的可能性提供了理論依據(jù)。

目前，對(duì)于鴿防御素的研究還有存在很多問(wèn)題有待進(jìn)一步探討，本研究克隆出的鴿AvBD 5α、鴿AvBD 5β及其生物學(xué)特性的研究結(jié)果為禽β-防御素代替抗生素成為新一代抗菌制劑提供了理論依據(jù)。

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