肖 冰 石玉秀 韓 芳

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，沈陽110001）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙 （posttraumatic stress disorder，PTSD）是指由于異常威脅性或災(zāi)難性心理創(chuàng)傷導(dǎo)致延遲出現(xiàn)和長期持續(xù)的精神障礙。其臨床表現(xiàn)以再度體驗創(chuàng)傷特征，并伴有情緒的易激惹和回避行為，簡而言之，PTSD是一種創(chuàng)傷后心理失衡狀態(tài)［1］。PTSD是應(yīng)激疾病中最為典型的一種［2］。研究報道，大腦內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)區(qū)在腦的情緒調(diào)節(jié)過程中起到重要的作用［3，4］。

研究發(fā)現(xiàn)，許多生理或病理條件均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白堆積、或鈣離子耗竭等，這些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)失衡即為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endo-plasmic reticulum stress，ERS）。為消除這種應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)迅即啟動未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），未折疊蛋白反應(yīng)是包括蛋白合成暫停、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和折疊酶表達上調(diào)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解等在內(nèi)的一種綜合性反應(yīng)［5］。GRP78存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白［6］。

本研究采用國際上公認(rèn)的SPS模型，采用免疫組 化、Western Blotting 和 RT-PCR 等 方 法 對PTSD大鼠前額皮質(zhì)神經(jīng)元GRP 78進行了檢測，旨在為研究GRP 78是否參與PTSD的發(fā)生，為揭示PTSD部分發(fā)病機制提供理論和形態(tài)學(xué)證據(jù)。

材料和方法

1.實 驗動物及動物模型的建立

采用6周-7周齡雄性Wistar大鼠（中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）60只，實驗起始體重（180±20）g，12h光亮／黑暗條件、22℃-25℃環(huán)境溫度，分隔喂養(yǎng)，食物和水可自由攝?。浑S機分為4組，即SPS的1d、4d、7d組及正常對照組。

2.P TSD樣大鼠模型的建立

采用日本文部省召開的“基礎(chǔ)和臨床的研究進展”的會議確定的關(guān)于PTSD模型—SPS刺激后無干擾喂養(yǎng)的方法。SPS刺激是指將大鼠連續(xù)進行下述步驟處理，即：大鼠禁錮2h后，立即強迫游泳20min（水深40cm，水溫25℃）。經(jīng)過15min的恢復(fù)，乙醚麻醉至意識喪失。大鼠經(jīng)過SPS處理后在籠子中不再給予任何刺激，分別常規(guī)飼養(yǎng)1天，4天，7天后取材。

3.光 鏡標(biāo)本制備

大鼠經(jīng)0.4%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，暴露心臟，左心室插管，剪開右心耳，先以生理鹽水300ml快速灌沖，再灌注4%多聚甲醛進行固定，取出腦組織，并浸入同種固定液中續(xù)固定3h，然后浸于 Holt＇S液（30%蔗糖，0.01mol／L PBS配制）中至沉瓶底。于恒冷箱冰凍切片機中行冠狀切片，片厚10μm，用于免疫熒光染色。

4.免 疫組化（PV法）進行GRP78染色與圖像分析

冰凍切片經(jīng)吹干用0.3%Triton（0.01mol／L PBS配制）洗5min×3次，3%H2O2室溫孵育30min，0.01mol／L PBS洗5min×3次，滴加小鼠抗大鼠GRP 78IgG（購于美國Sigma公司，工作濃度1∶100），4℃過夜后經(jīng)0.01mol／L PBS洗5min×3次，滴加羊抗小鼠IgG（PV試劑盒購于ZSGB-BIO公司）37℃孵育30min DAB顯色，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，BX60，Japan）下觀察，攝片。

應(yīng)用 MetaMorph／DPIO／BX41形態(tài)學(xué)圖象分析系統(tǒng)軟件，對上述免疫組化染色切片進行了半定量分析。在高倍（10×40倍）視野下，每張免疫組化染色切片取5個視野，記錄每個視野內(nèi)陽性細(xì)胞光密度值，取平均光密度。每組大鼠共選取5張切片，結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

5.免 疫印跡法測定

實驗組和對照組大鼠每組5只。脫頸法處死大鼠，斷頭，冰上快速分離前額皮質(zhì)，加入裂解液，考馬斯亮藍法蛋白質(zhì)定量后，聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜電轉(zhuǎn)印，封閉，小鼠抗大鼠GRP78一抗（1∶2000，Santa Cruz）4℃孵育過夜、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠1∶5000室溫孵育1h，ECL顯色。應(yīng)用Image J分析軟件分析上述結(jié)果，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的平均灰度值的比值表示蛋白水平，進行半定量分析。

6.逆 轉(zhuǎn)錄－－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測

將實驗組及對照組大鼠麻醉后斷頭取腦，分離前額皮質(zhì)，利用Trizol試劑提取總RNA，用分光光度計定量后-80℃保存。取1μgRNA，按照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，各引物序列見表1。GRP78 PCR 擴增條件均為：94℃ 2min；94℃ 30s；56℃30s；72℃40s；30個循環(huán)，72℃5min。β-actin PCR擴增條件：94℃ 4min；94℃ 40s；58℃ 30s；72℃30s；30個循環(huán)，72℃8min。擴增結(jié)束后取5μl擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用天能GIS凝膠成像系統(tǒng)進行觀察拍照并進行積分光密度分析，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的平均吸光度的比值表示相對表達水平，進行半定量分析。

表1 GRP78和β-actin引物序列Table 1 Primers for GRP78andβ-actin

7.統(tǒng) 計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)使用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件。計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，進行方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1.免 疫組化檢測GRP 78

GRP 78免疫組化結(jié)果顯示，正常組大鼠皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)中有GRP 78陽性信號，免疫組化染色陽性信號為棕黃色，陽性表達的GRP 78染色定位于細(xì)胞漿，細(xì)胞核反應(yīng)陰性。在正常對照組（圖A），GRP 78有一定量的表達，經(jīng)過SPS刺激后，在SPS 1d（圖B）、4d（圖C）、7d（圖D），GRP 78的表達出現(xiàn)逐漸上調(diào)，7d是表達最多（P＜0.05）。分析結(jié)果見圖1。

圖A 正常對照組GRP 78免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞 ×400 圖B SPS 1天組GRP 78免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞 ×400圖C SPS 4天組GRP 78免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞 ×400 圖D SPS 7天組GRP 78免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞 ×400Fig.A Immunoreaction of GRP 78in control group×400 Fig.B Immunoreaction of GRP 78in SPS 1dgroup×400Fig.C Immunoreaction of GRP 78in SPS 4dgroup×400 Fig.D Immunoreaction of GRP 78in SPS 7dgroup×400

圖1 模型組和對照組GRP 78的免疫組化結(jié)果分析Fig.1Immunohistochemistry analysis of GRP 78in the model group and control group

2.免 疫印跡法檢測前額皮質(zhì)GRP 78的表達

采用免疫印跡法檢測GRP 78，以β-actin的吸光度值作為內(nèi)參照，對各組條帶的吸光度值進行校正和半定量分析。與正常對照組相比，模型組前額皮質(zhì)GRP 78蛋白水平變化明顯：SPS刺激后1d后表達開始逐漸增加，7d表達最多（圖2-1）。分析結(jié)果見圖2-2.

3.R T-PCR檢測前額皮質(zhì)GRP 78mRNA的表達

PCR圖像（圖3）顯示，在正常組大鼠前額皮質(zhì)中GRP 78mRNA有少量表達，SPS刺激后，GRP 78mRNA的表達出現(xiàn)逐漸上調(diào)的趨勢（P＜0.05），分析結(jié)果見圖4.

圖2-1 模型組和對照組GRP 78蛋白的免疫印跡分析Fig.2-1Western blotting analysis of GRP 78protein in the model group and control group

討 論

近年來，隨著戰(zhàn)爭、社會暴力事件、重大交通事故和自然災(zāi)害等創(chuàng)傷意外的不斷增多，PTSD發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重影響了患者生活質(zhì)量和社會穩(wěn)定。不同于一般的應(yīng)激反應(yīng)及其它精神疾病，PTSD患者存在明顯的下丘腦－垂體－腎上腺軸負(fù)反饋抑制作用增強和低皮質(zhì)醇反應(yīng)及一定程度的海馬、杏仁核、Broca's區(qū)等結(jié)構(gòu)影響形態(tài)學(xué)改變［7，8］。以往由于缺乏理想的動物模型，使PTSD的基礎(chǔ)研究受到了很大限制。SPS模型作為PTSD動物模型的確認(rèn)，為深入研究應(yīng)激障礙的發(fā)病機制提供了行之有效的方法［9］。

GRP78又稱免疫球蛋白結(jié)合蛋白（Bip），是熱休克蛋白70家族的成員之一，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白。組織器官在缺血、鈣平衡紊亂等應(yīng)激情況下，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)可使GRP78大量表達［10］并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊和未折疊蛋白結(jié)合，恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，使蛋白質(zhì)能夠在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下、繼續(xù)正確合成，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［11］。研究報道，PTSD患者額葉內(nèi)側(cè)皮質(zhì)功能下降，對創(chuàng)傷事件的敏感度增加，可能與PTSD病人的闖入性記憶癥狀有關(guān)［12］。

本實驗中我們采用免疫組化和 Western blotting，重點觀察了PTSD大鼠前額皮質(zhì)內(nèi)GRP 78的變化。利用免疫組化證實了GRP78的存在，并且通過免疫印跡和RT-PCR技術(shù)分別從蛋白水平和mRNA水平對其進行了定量的檢測，檢測結(jié)果顯示GRP78表達在SPS刺激后發(fā)生了明顯的變化，出現(xiàn)了逐漸上調(diào)的趨勢。鑒于GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的重要作用以及大腦前額皮質(zhì)在情緒調(diào)節(jié)中的重要作用，PTSD大鼠前額皮質(zhì)GRP78表達的升高，說明PTSD存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，GRP78的表達變化可能與PTSD持續(xù)性情感行為障礙、認(rèn)知功能受損的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)。該實驗的研究結(jié)果證實了PTSD的發(fā)生有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，這也為進一步揭示PTSD神經(jīng)生物學(xué)發(fā)病機制以及開辟治療新途徑提供了實驗依據(jù)。但本實驗僅局限于對PTSD樣情感行為異常大鼠前額皮質(zhì)GRP 78的研究，關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激如何在PTSD的發(fā)生發(fā)展中如何起作用還有待于進一步的研究。

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