周敏 陳輝龍 程勝 梅麗 張惠蘭 謝敏 熊維寧 徐永健

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，武漢430030）

黏液的過度分泌是慢性呼吸道疾病支氣管哮喘的重要特征之一。氣道被黏液栓阻塞，引起急性呼吸衰竭，是導(dǎo)致哮喘發(fā)病率和死亡率增高的主要原因。近年來的研究認(rèn)為，氣道上皮中大量杯狀細(xì)胞增生和黏液蛋白Muc5ac的過度表達是哮喘黏液過度分泌的主要機制。眾多哮喘動物模型研究認(rèn)為，Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素IL-13，是誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生和Muc5ac過度表達的重要介質(zhì)［1］。

AGR2（anterior gradient-2）蛋白最早于1998年首次發(fā)現(xiàn)并克隆，是腸道細(xì)胞產(chǎn)生黏蛋白MUC2所必需的［2］。它是一種功能尚不清楚的分泌型小分子，在乳腺癌、前列腺癌等一系列腺癌中都存在表達。最近有研究報道，AGR2蛋白可能參與哮喘小鼠氣道黏液的過度分泌，而且作用與Muc5ac有關(guān)［3］。

本研究擬通過IL-13處理小鼠哮喘模型，檢測小鼠肺組織AGR2mRNA及蛋白的表達以及Muc5ac蛋白的表達，了解IL-13處理前后AGR2表達的變化，探討其在哮喘氣道黏液過度分泌的作用。

材料和方法

1.實 驗小鼠分組及哮喘模型的建立

6周齡SPF級雌性BALB／c小鼠（湖北省實驗動物研究中心）18只，體重（20±2）g，隨機分成正常對照組、哮喘組和IL-13組，每組6只。

1.1 哮喘組和IL-13組均在0d、7d、14d腹腔注射0.2ml含20μg卵蛋白（OVA，V級，Sigma公司）及2.25mg Al（OH）3的PBS溶液進行致敏，于21d－28d每天用1%OVA PBS溶液霧化吸入進行激發(fā)，每天一次，每次30min。

IL-13組在26d-28d每次激發(fā)前1h經(jīng)鼻滴入含100μg重組小鼠IL-13（Pepro Tech公司，美國）的PBS溶液，體積為0.5ml／只。

1.2 對照組用PBS溶液代替OVA行腹腔注射及霧化吸入激發(fā)，其余無特殊處理。

2.支 氣管肺泡灌洗及處理肺組織

各組小鼠最后一次激發(fā)24h后放血處死，在冰上分離結(jié)扎右主支氣管，迅速切除右肺置于RNasefree的1.5ml離心管中，液氮中急凍，于-80℃保存，用于Real time-PCR測定。用生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，注入0.4ml回抽，重復(fù)3次，獲得支氣管肺泡灌洗液（BALF）共約1ml。灌洗液回收置于高壓滅菌的離心管中，置于-4℃冰箱，2h內(nèi)作細(xì)胞分離。注入4%多聚甲醛0.3ml使左肺充盈，結(jié)扎氣管并浸入4%多聚甲醛中固定，用于免疫組化測定。

3.B ALF細(xì)胞計數(shù)

BALF液體以200g離心5min，細(xì)胞沉淀用0.5mlPBS液體重懸，取0.1ml在細(xì)胞計數(shù)板上測定細(xì)胞總數(shù)，取200μl涂片，Wright-Giemsa染色，顯微鏡下觀察300個細(xì)胞，進行嗜酸性細(xì)胞分類計數(shù)。

4.R eal time-PCR 檢測肺 組 織 AGR2mRNA表達

采用Trizol試劑（美國Invitrogen公司），參照說明對各組肺組織總RNA進行提取。取2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄（美國Invitrogen公司）cDNA，取2μlcDNA為模板，按照Takara公司試劑盒說明書在實時定量PCR儀（ABI Prism 7500HT）上進行檢測，肌動蛋白β-actin為內(nèi)參照，并設(shè)陰性對照。Real time-PCR 檢 測 試 劑 盒 （SYBR Premix Ex Taq）購 自Takara公 司，AGR2 上 游 引 物 5-ATGAGTGCCCACACAGTCAA-3，下游引物5-GGACATACTGGCCATCAGGA-3；β-actin 上 游 引 物 5-CGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3，下游引物5－TGATCTCCTTCTGCATCCTGTCGG-3［4］。

5.免 疫組化法檢測肺組織AGR2蛋白和Muc5ac蛋白表達

采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（SP）染色法，即切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后，用3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)，其余步驟按試劑盒說明書進行。用已知陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。實驗使用小鼠抗AGR2蛋白多克隆抗體（SANTA CRUZ公司），抗Muc5ac單克隆抗體（美國sigma），SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯（DAB）顯色試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）。AGR2抗體和Muc5ac抗體稀釋濃度均為1：100陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：高倍鏡下，細(xì)胞胞漿呈棕黃色著染為陽性細(xì)胞。三組小鼠肺組織免疫組化染色圖像經(jīng)Image-Proplus WIN32圖像分析系統(tǒng)進行蛋白表達強度半定量，測定5個視野的平均光密度。

6.統(tǒng) 計學(xué)處理

各指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，各組實驗數(shù)據(jù)均用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析，以P＜0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1.三 組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性細(xì)胞分類計數(shù)比較（n＝6，ˉx±s）

與正常對照組相比，哮喘組BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性細(xì)胞分類計數(shù)水平明顯增多，差異有顯著性（P＜0.01）；用IL-13處理后，細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性細(xì)胞分類計數(shù)明顯升高（P＜0.01），見表1。

2.三 組小鼠肺組織AGR2mRNA表達結(jié)果

和正常對照組相比，哮喘組AGR2mRNA的表達（1.52±0.071）明顯升高，差異有顯著性（P＜0.05）。IL-13組與哮喘組相比，AGR2mRNA的表達（1.702±0.046）升高（P＜0.05），見圖1。

表1 三組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性細(xì)胞分類計數(shù)比較（n＝6，ˉx±s）Table 1 Cell counts and eosinophils percent in BALF of three groups（n＝6，ˉx±s）

圖1 三組小鼠肺組織AGR2mRNA表達水平的比較Fig.1The relative level of AGR2mRNA expression in lung tissue of three groups（n＝6，ˉx±s）＊Compared with control，P＜0.01；＊＊Compared with Asthmatic group，P＜0.01

3.小 鼠肺AGR2和Muc5ac免疫組化染色結(jié)果

兩種蛋白主要表達于氣道上皮，陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞漿，Muc5ac蛋白在基底和肺泡表達弱，AGR2蛋白在肺泡有部分表達，見圖2、3。

4.三 組小鼠肺組織氣道AGR2和Muc5ac蛋白表達水平的比較

哮喘組Muc5ac和AGR2蛋白表達水平（0.535±0.054，0.505±0.078）與 正 常 對 照 組 （0.097±0.072，0.229±0.124）比較明顯升高（P＜0.01），IL-13組 Muc5ac和AGR2蛋白表達水平（0.608±0.037，0.617±0.028）與哮喘組比較升高（P＜0.05）。表2 三組小鼠肺組織AGR2和Muc5ac蛋白表達水平的比較（n＝6，ˉx±s）

Table 2 The expression of AGR2and Muc5ac protein in mice lung of three groups（n＝6，ˉx±s）

＊Compared with control，P＜0.01；▲Compared with Asthmatic group，P＜0.05

5.哮 喘小鼠肺組織AGR2mRNA和蛋白表達與Muc5ac蛋白表達之間的相關(guān)性

經(jīng)相關(guān)性分析表明，哮喘小鼠肺組織AGR2 mRNA表達水平與Muc5ac蛋白水平呈直線正相關(guān)（r＝0.862，P＜0.05），（見圖4）。AGR2蛋白與的Muc5ac蛋白水平呈直線正相關(guān)（r＝0.847，P＜0.05），見圖5。

圖4 AGR2mRNA 與 Muc5ac蛋白相關(guān)性 Fig.4The relative level of AGR2mRNA and Muc5ac protein圖5 AGR2蛋白與 Muc5ac蛋白水平相關(guān)性 Fig.5The relative level of AGR2protein and Muc5ac protein

討 論

哮喘是由多種細(xì)胞，特別是T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的慢性非特異性氣道炎癥，急性發(fā)作時黏液的大量分泌，伴有黏滯性增加，使得氣道內(nèi)黏液清除下降，引起阻塞，導(dǎo)致急性呼吸衰竭的發(fā)生。在參與哮喘黏液過度分泌的眾多炎性介質(zhì)與細(xì)胞因子中，以Th2型IL-13最具代表性，它能誘導(dǎo)氣道杯狀細(xì)胞增生，在引起哮喘氣道黏液過度分泌中起關(guān)鍵作用。其作用與上調(diào)氣道分泌型黏蛋白Muc5ac mRNA和蛋白的表達有關(guān)［1］，主要通過激活表皮生長因子受體EFGR實現(xiàn)［5］，機制復(fù)雜，涉及到STAT 6信號通路，Ras／MAPK通路、鈣離子活化氯通道（CLCAs）等多個途徑［6］。

分泌型小分子AGR2是一種胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）蛋白，分布非常廣泛，最早于1998年由Thompson DA和 Weigel RJ［2］在乳腺癌中首次發(fā)現(xiàn)并克隆。近年來發(fā)現(xiàn)它在食管癌、乳腺癌、前列腺癌等眾多腺癌細(xì)胞中高度表達，能促進腫瘤細(xì)胞的生長、遷移、轉(zhuǎn)化，是一個潛在的腫瘤檢測分子標(biāo)記物。AGR2是腸道產(chǎn)生黏蛋白MUC2所必需的，與炎性腸病和腸道上皮功能相關(guān)［7］。

2012年［3］有研究者發(fā)現(xiàn)AGR2在哮喘小鼠肺組織表達升高，而下調(diào)AGR2的表達后氣道分泌型黏蛋白Muc5ac表達減少。提示AGR2基因可能參與哮喘氣道黏液的過度分泌。Yu H［8］等的研究中發(fā)現(xiàn)在下調(diào)氣道上皮細(xì)胞IL-13表達過程中，同時伴有Muc5ac和AGR2表達水平的下降。

本研究中發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠肺組織AGR2mRNA和蛋白的表達水平均較正常水平增高，IL-13處理后明顯促進了AGR2mRNA和蛋白的表達，并且表達水平與Muc5ac蛋白表達水平呈明顯正相關(guān)。提示AGR2參與了哮喘氣道黏液過度分泌，IL-13可通過上調(diào)其表達，進一步促進黏蛋白Muc5ac表達。

［1］Turner J，Jones CE.Regulation of mucin expression in respiratory diseases.Biochem Soc Trans，2009，37（Pt 4）：877-881

［2］Thompson DA and Weigel RJ.hAG-2 ，the human homo-logue of the Xenopus laevis cement gland gene Xag-2，is coexpressed with estrogen receptor in breast cancer cell lines.Biophys Res Commun，1998，251（1）：111-116

［3］Schroeder BW，Verhaeghe C，Park SW，et al.AGR2is induced in asthma and promotes allergen-induced mucin overproduction.Am J Respir Cell Mol Biol，2012Mar 8［Epub ahead of print］

［4］Wang Z，Hao Y，Lowe AW.The adenocarcinoma-associated antigen，AGR2，promotes tumor growth，cell migration，and cellular transformation.Cancer Res，2008，68（2）：492-497

［5］Zhen G，Park SW，Nguyenvu LT，et al.IL-13and epidermal growth factor receptor have critical but distinct roles in epithelial cell mucin production.Am J Respir Cell Mol Biol，2007，36（2）：244-253

［6］Lai H，Rogers DF.New pharmacotherapy for airway mucus hypersecretion in asthma and COPD：targeting intracellular signaling pathways.J Aerosol Med Pulm Drug Deliv，2010，23（4）：219-231

［7］Ramachandran V，Arumugam T，Wang H，et al.Anterior gradient 2is expressed and secreted during the development of pancreatic cancer and promotes cancer cell survival.Cancer Res，2008，68（19）：7811-7818

［8］Yu H，Li Q，Kolosov VP，et al.Interleukin-13induces mucin 5AC production involving STAT6／SPDEF in human airway epithelial cells.Cell Commun Adhes，2010，17（4-6）：83-92