林翠英 葉維建 陳建明 姜雨飛 張燕琴 王世鄂＊

（莆田學院醫(yī)學院 福建351100；1福建醫(yī)科大學人體解剖學與組織胚胎學系生殖醫(yī)學中心，福州350004）

多數(shù)品系小鼠（如KM、CF-1等）早胚體外發(fā)育易出現(xiàn)“2-細胞阻滯現(xiàn)象”，即在離體培養(yǎng)條件下，小鼠受精卵（合子）經(jīng)一次分裂后，大多數(shù)停滯于2-細胞時期，很少能發(fā)育至桑葚胚或囊胚。有研究表明，線粒體超微結構缺陷可引起線粒體氧化磷酸化水平異常，導致線粒體代謝水平與胞質內局部能量需求不協(xié)調，從而引發(fā)早胚發(fā)育阻滯或異常［1］。前期研究也表明，2-細胞胚內線粒體功能低下是昆明（Kunming，KM）小鼠早胚體外培養(yǎng)出現(xiàn)2-細胞阻滯的重要原因［2］。近年來研究顯示，人參皂甙（Ginsenoside，Rg1）具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用，可能與其對細胞內線粒體活性保護和抑制凋亡作用有關［3，4］。此外，人參皂甙 Rg1可改善快速老化小鼠線粒體結構和功能障礙［5］。因此，本研究在M16培養(yǎng)液中添加人參皂甙Rg1，觀察其對KM小鼠早胚體外發(fā)育的影響，為進一步探討人參皂甙Rg1在小鼠早胚體外發(fā)育中的作用和機制提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1.材 料

1.1 實驗動物

KM小鼠購自上海斯萊克公司（雌鼠4-6周，雄鼠8周以上）。繼續(xù)飼養(yǎng)3-5d，調節(jié)生理周期，使其適應環(huán)境供實驗處理。

1.2 主要試劑和儀器

孕馬血清促性腺激素（PMSG）（ProSpec TechnoGene），人絨毛膜促性腺激素（hCG）（sigma），M2和 M16（sigma），倒置顯微鏡（Nikon），水套式二氧化碳培養(yǎng)箱（力康）。

2.方 法

小鼠早胚體外培養(yǎng) KM雌鼠腹腔注射5 IU PMSG，46-48h后注射5IU hCG，隨后與KM 雄鼠1∶1合籠。次晨檢查雌鼠陰栓，判斷是否受精。在注射hCG后28h從有陰栓雌鼠輸卵管中收集1-細胞胚，經(jīng)M2洗滌，M16漂洗3次，將形態(tài)完好的1－細胞胚移至預孵育好的M16培養(yǎng)液滴（其中分別含 0μmol／L、5μmol／L、10μmol／L、20μmol／L 的Rg1）中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)，每天觀察和記錄早胚發(fā)育情況，重復3次以上。

3.統(tǒng) 計學處理

由于各組從1－細胞胚體外培養(yǎng)到2－細胞胚的發(fā)育比率無明顯差別，為了排除卵母細胞未受精引起的發(fā)育差異，各組發(fā)育情況均采用以2-細胞胚數(shù)目為底計算百分率。用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，均以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

結 果

KM小鼠1－細胞胚分別在未添加和添加不同濃度Rg1的M16培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)觀察，結果發(fā)現(xiàn)：KM小鼠1-細胞胚經(jīng)M16培養(yǎng)液培養(yǎng)很少能發(fā)育至桑葚胚，只有極個別發(fā)育到囊胚；添加濃度為5μmol／L、10μmol／L、20μmol／L的 Rg1的 M16培養(yǎng)液能明顯提高KM小鼠1-細胞胚發(fā)育至桑葚胚的比率，而添加濃度為10μmol／L的Rg1的M16培養(yǎng)液能明顯提高KM小鼠1-細胞胚發(fā)育至囊胚的比率（表1，圖1、2）。

表1 Rg1對KM小鼠1－細胞胚體外發(fā)育的影響Table 1 Effect of Rg1on the development of KM mouse one-cell embryos in vitro

討 論

很多研究認為哺乳動物早胚體外發(fā)育阻滯或合子基因組激活延遲可能與細胞內活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）增多有關。將牛早胚置于高氧壓（20%O2）條件下培養(yǎng)，牛胚胎基因組激活明顯延遲或受抑［6］。然而有的學者卻認為ROS除了具有細胞毒性作用，其實還參與細胞正常的生理過程，如細胞的增殖、分化、凋亡和細胞信號轉導過程［7，8］。前期分別比較阻滯品系KM小鼠（♀KM╳♂KM）體內發(fā)育與體外培養(yǎng)所得2－細胞胚內ROS水平，以及KM小鼠（♀KM╳♂KM）與非阻滯品系B6C3F1小鼠（♀B6C3F1╳♂B6C3F1）體外培養(yǎng)2-細胞胚內ROS水平，結果顯示KM小鼠（♀KM╳♂KM）體外培養(yǎng)2-細胞胚內的ROS水平顯著低于體內發(fā)育，也低于體外發(fā)育B6C3F1（♀B6C3F1╳♂B6C3F1）小鼠2-細胞胚內的ROS水平。這些結果提示在正常培養(yǎng)條件下，胚內ROS水平適度升高有利于早胚發(fā)育［2，9］，由于線粒體是需氧生物ATP合成的主要場所，而線粒體呼吸鏈電子漏同時也是機體ROS產(chǎn)生的重要來源［10］。因此，前期進一步比較KM小鼠和B6C3F1小鼠體外培養(yǎng)的2－細胞胚內線粒體膜電位水平和ATP的含量，結果表明KM小鼠2－細胞胚線粒體功能明顯比B6C3F1小鼠的低下，提示2－細胞胚內線粒體功能低下是KM小鼠早胚體外培養(yǎng)出現(xiàn)2－細胞阻滯的重要原因［2］。

人參皂甙Rg1作為三七總皂甙中含量最高的單體，對神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛的生物學作用，對認知功能障礙有改善作用，可以提高神經(jīng)可塑性，激活學習記憶信號轉導途徑，促進海馬神經(jīng)元發(fā)生，還具有神經(jīng)保護和促進神經(jīng)修復、誘導神經(jīng)干細胞分化等作用［3，4，11，12］。有研究表明，腦缺血再灌注后人參皂甙Rg1能明顯改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能、降低腦梗死體積及減輕腦水腫程度。同時，人參皂甙Rg1能明顯地減輕線粒體損傷，對缺血再灌注造成的線粒體ATP酶、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細胞色素C氧化酶 及 超 氧 化 物 歧 化 酶 （superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性的降低有明顯的上調作用，降低丙二醛的含量［13］。Korivi等研究顯示人參皂甙Rg1明顯增高運動疲勞性大鼠肝內谷胱甘肽水平，增強SOD、過氧化氫酶和GSH-Px活性，同時能抑制運動疲勞性大鼠肝內黃嘌呤氧化酶活性和降低一氧化氮水平，減少自由基對肝臟的氧化損傷［14］。又有研究表明，人參皂甙Rg1能夠改善快速老化小鼠的線粒體功能異常及其結構損傷，表現(xiàn)為提高線粒體膜電位，改善線粒體氧化還原能力，減輕線粒體膜腫脹程度［5］。因此，本研究選擇人參皂甙Rg1作為添加劑，添加不同濃度人參皂甙Rg1至M16培養(yǎng)液中，觀察人參皂甙Rg1對昆明小鼠早胚發(fā)育的影響，結果表明，添加濃度為5μmol／L、10μmol／L、20μmol／L的Rg1的M16培養(yǎng)液能明顯提高KM小鼠1-細胞胚發(fā)育至桑葚胚的比例，而添加濃度為10μmol／L的Rg1的M16培養(yǎng)液能明顯提高KM小鼠1－細胞胚發(fā)育至囊胚的比例。這是否與人參皂甙Rg1具有抗氧化和改善線粒體功能、維持線粒體膜的完整性有關，有待于進一步研究。

此外，Chan等研究認為人參皂甙Rg1具有類雌激素活性，應定義為一種新型的植物雌激素［15］。人參皂甙Rg1能不依賴配體激活的雌激素受體α（Estrogen receptor alpha，ERα）途徑，而是通過快速誘導ERα轉錄激活功能域-1（activation function-1，AF-1）的絲氨酸118殘基的磷酸化，發(fā)揮類雌激素活性［16］。那么，人參皂甙Rg1促進KM小鼠早胚體外發(fā)育是否僅與其發(fā)揮類雌激素活性有關，還是人參皂甙Rg1發(fā)揮類雌激素作用，達到抗氧化改善線粒體功能和維持線粒體膜完整性等生理效應，從而有利于早胚體外發(fā)育。其詳細作用機制，需要進一步研究闡明。

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圖 版 說 明

圖1 在M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)的KM小鼠不同發(fā)育階段早胚（bar＝100μm）1A、注射hCG后64h；1B、注射hCG后80h；1C、注射hCG后112h

圖2 在添加10μmol／L Rg1的 M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)的KM小鼠不同發(fā)育階段早胚（bar＝100μm）2A、注射hCG后64h；2B、注射hCG后80h；2C、注射hCG后112h

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1Different stages of KM early embryos cultured in M16 medium （bar＝100μm）1A.Post-hCG 64h；1B.Post-hCG 80h；1C.PosthCG 112h

Fig.2Different stages of KM early embryos cultured in M16 medium with 10μmol／L Rg1（bar＝100μm）2A.Post-hCG 64h；2B.Post-hCG 80h；2C.PosthCG 112h