陜 光 夏 樾

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿Ⅱ科 湖北430060）

TIP30／CC3（Tat interacting protein 30）基因是2007年由國(guó)外學(xué)者首先報(bào)道的一種與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)的基因［1］，其編碼產(chǎn)物TIP30／CC3蛋白是一種絲氨酸、蘇氨酸激酶，以細(xì)胞輔助因子為個(gè)體，具有活化并增高HIV-1轉(zhuǎn)錄功能，可特異性地提高HIV-1增殖調(diào)節(jié)蛋白Tat的轉(zhuǎn)錄［2］。TIP30基因具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管形成等作用［3－5］。

我們通過免疫組織化學(xué)方法觀察TIP30／CC3蛋白與膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)，以期能進(jìn)一步探討其在膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為腫瘤的靶向治療提供新的依據(jù)。

材料和方法

1.材 料

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2004-2006年膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊50例（均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年齡50.3歲，另5例癌旁組織距瘤緣3-5cm做對(duì)照。標(biāo)本均經(jīng)HE染色，光鏡觀察診斷，按 WHO尿路腫瘤組織學(xué)分類（2004），浸潤(rùn)性尿路上皮癌30例，非浸潤(rùn)性乳頭狀尿路上皮癌；高級(jí)別15例，低級(jí)別5例；按 UICC臨床分期，T1 31例，T2 11例，T3-4 8例。其中未經(jīng)化療的初發(fā)腫瘤28例，化療后復(fù)發(fā)腫瘤22例。

2.方 法

2.1 HE染色

常規(guī)取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色及封片。

2.2 主要試劑

即用型兔抗人TIP30／CC3多克隆抗體（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

2.3 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)TIP30／CC3相關(guān)抗原

具體步驟：5μm組織切片常規(guī)脫蠟至水后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；抗原修復(fù)，室溫自然冷卻后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗5×3min；滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；甩去多余血清，分別滴加一抗，4℃孵育過夜，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃濕盒孵育10min，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育10min，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3 min；滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應(yīng)時(shí)間（約3-5min），自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，購(gòu)買的陽性片作為TIP30／CC3的陽性對(duì)照。

2.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

2.4.1 TIP30／CC3以胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性對(duì)照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

2.4.2 采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對(duì)TIP30／CC3的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

3.統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理

對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1.T IP30／CC3的表達(dá)

尿路上皮癌細(xì)胞中可見少量的棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈低表達(dá)（圖1）；癌旁正常膀胱組織上皮中可見密集分布的棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈高表達(dá)（圖2）。圖像分析結(jié)果見表。經(jīng)q檢驗(yàn)，膀胱尿路上皮癌與癌旁膀胱組織之間，TIP30／CC3的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05）（表1）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁正常膀胱組織TIP30／CC3表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（ˉx±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of TIP30／CC3 in bladder urothelial cancer and cancer side tissue（ˉx±s）

2.T IP30／CC3基因與膀胱尿路上皮癌臨床和病理特征的關(guān)系

TIP30／CC3的表達(dá)與患者年齡、性別之間的差異均無顯著性（P＞0.05）。但與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度和臨床UICC分期之間的差異均有顯著性 （P＜0.05）（表2）。

表2 TIP30／CC3與膀胱尿路上皮癌病理分級(jí)臨床分期的關(guān)系Table 2 TIP30／CC3with the correlation of Pathologic type and TNM stag of Bladder Urothelial Cancer

討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其中90%以上為膀胱尿路上皮癌，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟的過程，探討膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)膀胱尿路上皮癌的早期診斷、治療方式的選擇及預(yù)后判斷等方面具有重要價(jià)值［6］。

人的TIP30蛋白是能特異性地提高HIV-1增殖調(diào)節(jié)蛋白Tat的轉(zhuǎn)錄輔助因子，其序列與CC3蛋白是相同的，而CC3蛋白是與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制有關(guān)的［7］。TIP30／CC3是短鏈脫氫酶／還原酶（SDR）家族的一個(gè)成員，也是一個(gè)絲氨酸／蘇氨酸激酶［8－10］。它的抑癌功能不斷得到發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，作用機(jī)制也被不斷深入研究，為腫瘤治療帶來了新的希望。一些新的促凋亡途徑的提出，加深了人們對(duì)這一方面的了解。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤轉(zhuǎn)移表型和細(xì)胞凋亡之間存在著密切關(guān)系，誘導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡可以抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移［11］。分子生物學(xué)試驗(yàn)表明，TIP30促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能是通過該基因作為轉(zhuǎn)錄輔助因子，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和血管新生相關(guān)基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的［12－14］。

我們采用免疫組織化學(xué)的方法，對(duì)膀胱尿路上皮癌組織中TIP30／CC3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討其與膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TIP30／CC3在膀胱尿路上皮癌中呈低表達(dá)，而在癌旁組織中呈高表達(dá)，差異有顯著性。癌癥的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，是多因素、多基因發(fā)生改變所造成的。通過我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示：抑癌基因TIP30在膀胱尿路上皮癌組織中的失表達(dá)可能促進(jìn)了膀胱尿路上皮癌發(fā)生。抑癌作用是一個(gè)復(fù)雜的多因素共同作用的。TIP30／CC3基因具有促凋亡作用，它通過高表達(dá)可以上調(diào)一系列促凋亡基因的表達(dá)，以抑制腫瘤生長(zhǎng)。而癌旁組織中TIP30的高表達(dá)可以抑制膀胱尿路上皮癌的發(fā)生和發(fā)展。對(duì)臨床的早期診斷及治療起到指導(dǎo)性作用。同時(shí)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示：TIP30／CC3基因與與膀胱尿路上皮癌病理分級(jí)、臨床分期差異有顯著性（P＜0.05）。提示：TIP30／CC3可能參與了膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)的過程。因此，進(jìn)一步研究TIP30基因與膀胱尿路上皮癌其它生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)系及其相互作用機(jī)制，將有助于了解膀胱尿路上皮癌發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療。今后的實(shí)驗(yàn)中我們將進(jìn)一步探索TIP30基因在多種腫瘤組織表達(dá)降低的機(jī)制，涉及到哪些分子調(diào)控通路，并希望通過基因或蛋白水平的干預(yù)來阻斷其分子調(diào)控通路，為今后多種腫瘤的生物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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圖 版 說 明EXPLANATION OF FIGURES

圖1 TIP30／CC3的表達(dá)：膀胱尿路上皮癌 細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈陰性表達(dá)（→）。SP×200

圖2 TIP30／CC3的表達(dá)：癌旁正常膀胱組織 細(xì)胞核和胞漿內(nèi)可見較多棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈陽性表達(dá)（→）。SP×200

Fig.1The expression of TIP30／CC3：bladder urothelial cancer group：There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed TIP30／CC3expressed negative.SP×200

Fig.2The expression of TIP30／CC3：cancer side tissue：There were plenty of brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed TIP30／CC3expressed positive.SP×200