孫兆翎，韓 萍，吳維光，唐雅娟

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000)

反義寡核苷酸(ASODN)因技術(shù)簡單、低毒副作用和高特異性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種腫瘤相關(guān)基因沉默的實(shí)驗(yàn)研究［1］。宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，李曉蕾等［2］研究證明宮頸癌組織中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)異常升高，并與病理分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。已確認(rèn)STAT3在多種腫瘤的細(xì)胞中表達(dá)升高，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成、免疫逃避和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，運(yùn)用各種方法抑制STAT3基因表達(dá)將促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［3］。我們于2011年3～12月進(jìn)行本研究，利用STAT3 ASODN技術(shù)轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞，抑制STAT3蛋白表達(dá)，觀察其對HeLa細(xì)胞體外侵襲能力的影響，探討STAT3信號通路在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌細(xì)胞株HeLa購于武漢典型生物保藏中心，胎牛血清購于杭州四季青公司，RPMI 1640培養(yǎng)液購于Gibco公司，Lipofectimane 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購于Invitrogen公司，STAT3單克隆抗體購于Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗購于Rockland公司。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的寡核苷酸由上海博亞生物工程有限公司合成，為全硫代修飾。

1.2 STAT3寡核苷酸設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)染 STAT3寡核苷酸序列參考文獻(xiàn)［4］，反義序列:5'-GCTCCAGCATCTGCTGCTTC-3'，正義序列:5'-GAAGCAGCAGATGCTGGAGC-3'。HeLa細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含100 mg/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2.5 g/L胰酶消化傳代。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)50%時轉(zhuǎn)染STAT3寡核苷酸，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 RT-PCR檢測STAT3 mRNA表達(dá) TRIzol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，GAPDH為內(nèi)參照。STAT3引物序列為:上游 5'-CCATACCTGAAGACAAGTTTATC-3'，下游5'-TGGAAATAATGGTGAAGGTGCTG-3'，擴(kuò)增片斷為125 bp。GAPDH引物序列為:上游5'-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3'，下游 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'，擴(kuò)增片斷為315 bp。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min，95℃ 30 s、52℃ 45 s、72℃1 min 35個循環(huán)后再72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，掃描條帶，以特異擴(kuò)增條帶與內(nèi)參條帶光密度之比作半定量分析。

1.4 Western blot檢測STAT3蛋白表達(dá) 配制試劑，收集細(xì)胞，裂解緩沖液提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)Bradford法定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將電泳后分離的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，麗春紅染色5 min，脫色，搖床上封閉1 h，加STAT3單克隆抗體(1∶400)，溫室孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min。再加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫下反應(yīng)2 h后，TBST洗膜，ECL發(fā)光壓片顯色，拍照分析圖像。

1.5 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞定植能力 在6孔培養(yǎng)板中每孔加入1.4 mL的0.6%底層瓊脂糖，待底層瓊脂糖凝固。取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化成單個細(xì)胞懸液并調(diào)整濃度為10 000個/mL。每孔再加入1 mL的0.3%上層瓊脂糖和100 μL單細(xì)胞懸液，待頂層瓊脂糖凝固后，放置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)軟瓊脂中細(xì)胞克隆數(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個平行孔。

1.6 體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 取25 μL的Matrigel稀釋液加入Transwell板上室，覆蓋整個聚碳酯膜，待Matrigel聚合成膠。在Transwell板上室加入100 μL細(xì)胞懸液(5×105個/mL)和培養(yǎng)液200 μL。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，用棉簽擦去Matrigel膜上未穿過的細(xì)胞，Gimsa染液染色，在高倍鏡下隨機(jī)取10個視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，取平均數(shù)。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 STAT3基因mRNA檢測結(jié)果 HeLa組、HeLaSTAT3-SODN組、HeLaSTAT3-ASODN組STAT3基因mRNA檢測結(jié)果分別為、0.64±0.09、0.66±0.11、0.39± 0.10，組間比較P＜0.05。其中HeLaSTAT3-ASODN組與HeLa組和HeLaSTAT3-SODN組比較 STAT3基因 mRNA表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)，而 HeLa組與HeLaSTAT3-SODN組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 細(xì)胞STAT3 mRNA PCR檢測圖

2.2 STAT3基因蛋白檢測結(jié)果 HeLaSTAT3-ASODN組、HeLaSTAT3-SODN組、HeLa組細(xì)胞 STAT3蛋白分別為0.39±0.13、0.68±0.14、0.68±0.11，組間比較P＜0.05。其中HeLa組與HeLaSTAT3-SODN組STAT3基因蛋白表達(dá)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但HeLaSTAT3-SODN組、HeLa組STAT3基因蛋白表達(dá)量均高于HeLaSTAT3-ASODN組(P＜0.05)。見圖2。

圖2 細(xì)胞STAT3蛋白Western印跡結(jié)果

2.3 軟瓊脂中細(xì)胞集落數(shù)檢測結(jié)果 HeLa組、HeLaSTAT3-SODN組、HeLaSTAT3-ASODN組的細(xì)胞集落數(shù)分別為(74.31±7.62)、(71.57±6.92)和(45.18± 7.69)個，前兩組細(xì)胞集落個數(shù)明顯高于HeLaSTAT3-ASODN組(P 均 ＜0.05)，而 HeLa組與HeLaSTAT3-SODN組之間無明顯差異(P＞0.05)。

2.4 穿透Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)檢測結(jié)果 穿透Matrigel膜的細(xì)胞數(shù) HeLa組(44.85±6.26)個、HeLaSTAT3-SODN組(45.46±6.79)個和 HeLaSTAT3-ASODN組(22.41±5.98)個，組間比較 P＜0.05。HeLaSTAT3-ASODN組穿透Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)量比前兩組均明顯減少(P＜0.05)，而 HeLa組與HeLaSTAT3-SODN組之間無明顯差異(P＞0.05)。見封3圖14。

3 討論

STAT3 ASODN是人工合成的，可與STAT3 mRNA特定區(qū)域結(jié)合約20個堿基的DNA或RNA片段，阻止STAT3 mRNA翻譯。ASODN目前研究較為成熟，從ASODN片段的設(shè)計(jì)、轉(zhuǎn)染載體的選擇，到轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 ASODN的濃度均有良好的可控性。Jing等［5］設(shè)計(jì)的四聯(lián)體寡核苷酸，現(xiàn)已證實(shí)能明顯抑制STAT3基因的激活。本研究應(yīng)用具有穩(wěn)定抑制效果的硫代修飾的STAT3 ASODN轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞，為觀察和評價STAT3基因?qū)m頸癌He-La細(xì)胞侵襲和定植能力的影響提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本次實(shí)驗(yàn)參照設(shè)計(jì)的STAT3 ASODN能有效抑制 HeLa細(xì)胞中 STAT3基因的mRNA及蛋白水平，在轉(zhuǎn)染有STAT3 ASODN的He-La細(xì)胞軟瓊脂中克隆細(xì)胞集落數(shù)也明顯少于前兩組，與Sun等［6］在抑制STAT3基因表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)的影響結(jié)論相吻合。充分證實(shí)STAT3基因與細(xì)胞定植能力密切相關(guān)，抑制STAT3基因異常表達(dá)，將明顯抑制腫瘤細(xì)胞的定植能力。其機(jī)制可能是作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要因子STAT3與多條轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)聯(lián)，即可被多種因子激活，又調(diào)控下游多種基因表達(dá)，其被異常激活后直接調(diào)控下游基因，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展［7］。文獻(xiàn)報道與腫瘤增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)的，并受STAT3基因調(diào)控的基因有VEGF、cyclinD1、c-myc、Survivin、Bcl-xl、Mcl-1、MMPs等［8］。這些下游基因調(diào)控腫瘤組織新生血管形成，腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)免疫耐受，逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視作用，控制細(xì)胞周期，抑制其凋亡，提高細(xì)胞生存活力，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的定植能力。STAT3基因如同這些下游基因的總的閘門，抑制其在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，通過直接下調(diào)VEGF、cyclinD1、c-myc、Survivin等，上調(diào)Bcl-xl、Mcl-1等基因表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、減弱定植能力。顯而易見，對STAT3基因的影響將成為抑制細(xì)胞定植能力的關(guān)鍵點(diǎn)。

在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，HeLaSTAT3-SODN組及HeLa組穿透Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)高于 HeLaSTAT3-ASODN組，此結(jié)果為STAT3基因與HeLa細(xì)胞侵襲能力相關(guān)提供了有力證據(jù)。抑制STAT3基因能有效抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移［9］。惡性腫瘤通過自身分泌并釋放蛋白水解酶，降解基質(zhì)膜和細(xì)胞外基質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞侵入外基質(zhì)及血管內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)局部浸潤及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。在此過程中，MMPs及VEGF發(fā)揮重要作用，有文獻(xiàn)報道MMPs與VEGF是STAT3的下游基因，直接受STAT3調(diào)控［10］。Silver等［11］研究表明，STAT3與癌細(xì)胞間相互粘連，與血管壁黏附密切相關(guān)。發(fā)揮重要作用的細(xì)胞黏附分子主要是通過酪氨酸磷酸化蛋白和局部黏著斑激酶起作用。阻斷STAT3基因功能將直接調(diào)控下游MMPs、VEGF基因表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

本研究發(fā)現(xiàn)STAT3 ASODN能有效抑制HeLa細(xì)胞的定植和侵襲能力，為控制宮頸癌浸潤及轉(zhuǎn)移提供新的靶點(diǎn)。

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