陳雪玲，姜 峰

(武漢市兒童醫(yī)院，武漢430016)

長期以來，有關(guān)學(xué)習(xí)記憶的研究更多使用電生理學(xué)指標，即長時程增強(LTP)。而目前越來越多的生物學(xué)基礎(chǔ)研究表明，c-fos等即刻早期基因的表達與學(xué)習(xí)和記憶有某種相關(guān)性，短時記憶和長時記憶有著不同的神經(jīng)機制，前者只需要原有蛋白質(zhì)分子的共價修飾，后者則要求合成新的信使核糖核酸和蛋白質(zhì)分子，即有相應(yīng)的結(jié)構(gòu)變化。

近年來發(fā)現(xiàn)，電刺激成年大鼠C類纖維及自然傷害性刺激或急性神經(jīng)損傷可使脊髓背角誘發(fā)電位產(chǎn)生LTP［1］，研究認為這是突觸傳遞效率持續(xù)性增強的表現(xiàn)。c-fos基因的持續(xù)表達對長期記憶的保持是必需的，目前正逐漸成為學(xué)習(xí)記憶功能研究的客觀指標之一。

本實驗室以前的工作表明，電刺激成年大鼠坐骨神經(jīng)后，可在脊髓、海馬等部位記錄到場電位，即LTP的產(chǎn)生。同時觀察到，給予成年大鼠強直電刺激后，海馬c-fos神經(jīng)元表達顯著增加，且傷害性電刺激幼鼠，同樣可以在脊髓部位記錄到LTP現(xiàn)象。但傷害性刺激幼鼠坐骨神經(jīng)能否引起c-fos蛋白表達的增加，國內(nèi)外尚未見報道。我們于2008年9月～2010年12月進行本研究，將探討電刺激坐骨神經(jīng)后不同時間幼鼠脊髓、海馬神經(jīng)元c-fos蛋白的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與藥品 用RM6240B多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)進行記錄，江灣I-C型立體定向儀為第二軍醫(yī)大學(xué)器材處生產(chǎn)。PBS灌流液、即用型兔抗鼠c-fos單克隆抗體、即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸，均購于北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物分組與處理 實驗對象為雄性SD幼鼠(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供)，日齡35～50 d，體質(zhì)量87～125 g，共30只。根據(jù)實驗設(shè)計將幼鼠隨機分為3組:空白對照組(A組，n=6)，單個電刺激組(B組，n=6)，強直電刺激組(C組，n= 18)。強直電刺激組包括強直刺激1 h組(C1組)、2 h組(C2組)、3 h組(C3組)。實驗完畢后，將各組動物脊髓和海馬神經(jīng)元行免疫組織化學(xué)染色，觀察各組動物脊髓和海馬神經(jīng)元內(nèi)c-fos表達。

1.3 刺激與記錄 A、B、C組幼鼠均腹腔注射10%烏拉坦(1 g/kg)麻醉。A組直接處死，切取脊髓和海馬進行免疫組織化學(xué)實驗觀察。B、C組常規(guī)氣管插管后分離左側(cè)坐骨神經(jīng)，不銹鋼雙極刺激電極置于左側(cè)坐骨神經(jīng)上，液體石蠟保護神經(jīng)，用RM6240多道生理信號采集處理系統(tǒng)給予B組幼鼠單方波(7 V、0.5 ms、1次/min、30 min)刺激左側(cè)坐骨神經(jīng)(10 s、4次)，繼而開胸灌注固定，處死幼鼠，切取動物脊髓和海馬進行免疫組織化學(xué)實驗觀察; C組給予強直刺激(20 V、0.5 ms、100 Hz、持續(xù)1 s、間隔10 s、4次)，再以上述同樣參數(shù)的單方波刺激左側(cè)坐骨神經(jīng)，而后分別在施加強直刺激后1 h、2 h、3 h對C1、C2、C3組幼鼠開胸灌注固定，處死大鼠，切取各組動物脊髓和海馬進行免疫組織化學(xué)實驗觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)SP法檢測c-fos相關(guān)抗原 具體步驟參照試劑盒說明書。用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為c-fos的陽性對照組。c-fos以細胞核或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照組除細胞核染成藍色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)(同濟千屏影像公司)對c-fos的表達進行定量分析，每張切片隨機選取15個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400)，測定每個視野下陽性細胞。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用±s表示。組內(nèi)比較采用自身配對t檢驗，組間比較采用成組t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

A組脊髓和海馬神經(jīng)元內(nèi)可見極少量的棕黃色顆粒，c-fos表達極弱或無表達;B組和C組脊髓和海馬神經(jīng)元內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，c-fos表達強。C2組脊髓和海馬神經(jīng)元內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，c-fos呈強陽性表達;C1組、C3組脊髓和海馬神經(jīng)元內(nèi)可見一些棕黃色顆粒，c-fos呈陽性表達。見表1及插頁Ⅰ圖5。

表1 各組c-fos陽性細胞數(shù)(±s)

表1 各組c-fos陽性細胞數(shù)(±s)

注:與A組比較，*P＜0.05;與C2組比較，△P＜0.05

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3 討論

正常情況下c-fos基因參與神經(jīng)細胞的生長、發(fā)育、分化、記憶和信息傳遞過程，同時也是細胞對外界刺激—轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)的參與物，因此在信息傳遞過程中起著“第三信使”的作用［2］。c-fos癌基因是由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成的9 kb的DNA片段，其基因序列高度保守，人與大鼠c-fos基因編碼區(qū)內(nèi)的相同序列超過9 000。在體外離體實驗證實，多種刺激因子，如缺氧、光線刺激、機械刺激、疼痛等均可誘導(dǎo)c-fos基因的表達。c-fos的表達可作為接受一定刺激的神經(jīng)元激活的標志。運用原位雜交技術(shù)或免疫組化技術(shù)顯示c-fos mRNA以及c-fos在DNA的分布，已被廣泛應(yīng)用于追蹤各種刺激尤其是疼痛刺激的傳導(dǎo)通路，確認參與反應(yīng)的多級神經(jīng)元的定位研究。

正常情況下，細胞內(nèi)僅有少量c-fos表達，當受到外界刺激后c-fos mRNA數(shù)分鐘開始升高，30 min開始達到高峰，120 min后表達開始減少。在應(yīng)激1～2 h后c-fos的蛋白產(chǎn)物迅速合成，可以用免疫組織化學(xué)的方法檢測到［3］。同時，越來越多的證據(jù)表明，c-fos基因的表達和蛋白的生物合成對于易化學(xué)習(xí)記憶過程至關(guān)重要［4］。

c-fos基因的表達需要電壓依賴性鈣通道，也有不少學(xué)者認為其與NMDA受體的活動有關(guān)［5］。學(xué)習(xí)記憶在細胞水平上的機制為LTP，它取決于神經(jīng)細胞永久性功能的變化，而這一過程則要求基因表達上的重新編程。c-fos基因正是作為這一過程中的第三信使來調(diào)節(jié)核內(nèi)其他靶基因的表達從而影響學(xué)習(xí)記憶的。一般認為LTP的形成與興奮性氨基酸受體相關(guān)，它的產(chǎn)生依賴于Mg2+的電壓依賴性的NMDA受體參與，以及Ca2+依賴的PKC及PLC耦聯(lián)的mGluRs的激活。Meller等認為non-NMDA受體(KA/AMPA)主要介導(dǎo)的是快速興奮性突觸反應(yīng)，在脊髓中多突觸傷害感受信息處理中主要介導(dǎo)反射性反應(yīng)，而NMDA受體的激活將導(dǎo)致神經(jīng)元的LTP和中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性改變［6］。

海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，它與丘腦前核群、板內(nèi)核群、下丘乳頭丘腦束、扣帶回等組成環(huán)路，是調(diào)節(jié)行為、學(xué)習(xí)和記憶、情緒反應(yīng)的重要神經(jīng)解剖學(xué)基礎(chǔ)［7］。在海馬齒狀回，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的LTP被誘導(dǎo)的同時，也伴有包括c-fos在內(nèi)的即早基因的激活。提示c-fos等即早基因的表達與學(xué)習(xí)和記憶有某種相關(guān)性。脊髓背角是機體對于傷害性信息進行自身調(diào)制或整合的最重要位點之一。本實驗室以前工作觀察到，電刺激坐骨神經(jīng)可在脊髓、海馬CA1區(qū)記錄到誘發(fā)場電位，說明外周感受器可將各種傷害性刺激轉(zhuǎn)變成電信號，進行動作電位的傳導(dǎo)并傳遞，即坐骨神經(jīng)的感覺沖動可進行傳導(dǎo)并傳遞至海馬。研究表明，c-fos基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達與痛覺調(diào)控密切相關(guān)。而本實驗所施加強直電刺激作為一種傷害性電刺激施加于幼鼠坐骨神經(jīng)，進而誘導(dǎo)c-fos蛋白的表達。有較多作者認為cfos蛋白的表達可能啟動和調(diào)控海馬內(nèi)特殊靶基因的表達，并通過最終表達產(chǎn)物發(fā)揮對缺血損傷后細胞的保護修復(fù)及突觸重塑功能。1987年英國的Hunt等首先將原癌基因用于痛覺研究，他們證明傷害性刺激引起大鼠c-fos免疫陽性反應(yīng)神經(jīng)元主要集中在背角的Aδ和C類纖維傳入終止的Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ層，而非傷害性傳入終止的Ⅲ、Ⅳ層很少有標記細胞。這一重要發(fā)現(xiàn)已被許多實驗室證實，多種傷害性刺激包括機械性(如止血鉗重夾皮膚)、化學(xué)性(如Formalin、芥子油、乙酸)等，均可誘導(dǎo)c-fos在脊髓背角Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ和Ⅹ層神經(jīng)元的表達。

研究表明，c-fos與其他即早基因的表達產(chǎn)物通過亮氨酸拉鏈形成同源性或異源性二聚體復(fù)合物——轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1結(jié)合至靶基因啟動子的活化蛋白-1位點，促使神經(jīng)細胞對刺激、損傷產(chǎn)生不同的適應(yīng)性變化，增強神經(jīng)元的修復(fù)能力，加速神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的重建，以恢復(fù)其正常功能。

本實驗觀察到強直電刺激坐骨神經(jīng)2 h后，海馬、脊髓與強直后1 h及3 h組比較，c-fos神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，而強直刺激坐骨神經(jīng)后1 h與3 h海馬和脊髓c-fos蛋白數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異。但本實驗室以前實驗觀察到，電刺激幼鼠坐骨神經(jīng)，在脊髓記錄到LTP平均可維持4 h，提示c-fos蛋白的表達可能參與了LTP誘導(dǎo)期的形成，其機制還需進一步研究。通過強直電刺激坐骨神經(jīng)后，在幼鼠脊髓、海馬部位c-fos蛋白表達增加，這與本實驗室所做強直電刺激坐骨神經(jīng)在脊髓、海馬部位可以記錄到LTP相一致，而不少學(xué)者把LTP與學(xué)習(xí)記憶聯(lián)系起來，并認為它可能是學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)，進而提示cfos蛋白可能在學(xué)習(xí)與記憶的活動中起著重要的調(diào)控作用。

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