劉志良，石磊芝，杜亞明*

(1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000;2浙江醫(yī)院)

食管癌是人類六大常見的惡性腫瘤之一，也是危害我國(guó)的主要惡性腫瘤之一，主要以食管癌鱗癌為主。治療主要是以手術(shù)為主的綜合治療，雖然我們手術(shù)對(duì)淋巴結(jié)清掃力度加大，但是5年生存率仍然不高。為了尋找更合理有效的治療方法，我們需要對(duì)食管癌做進(jìn)一步的研究。近幾年，腫瘤干細(xì)胞(CSCs)學(xué)說認(rèn)為CSCs是腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、耐藥等的根源［1］。HIWI基因是重要的干細(xì)胞標(biāo)記物之一，在食管癌組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)，表達(dá)水平與腫瘤的侵潤(rùn)深度、組織學(xué)分級(jí)及預(yù)后有密切的關(guān)系［2］。2011年6月～2012年1月，本研究旨在應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)降低食管癌細(xì)胞系中HIWI的表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞:食管癌細(xì)胞系Eca-109購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。主要試劑:山羊抗人HIWI多克隆抗體(Santa Cruz公司);二抗:免疫熒光所用兔抗山羊IgG-TRITC TRITC-goat Anti-Mouse IgG，購(gòu)自武漢博士德公司;胎牛血清(天津?yàn)蠊?，RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶(Gibco公司)。HIWI siRNA由上海吉瑪公司合成，正義鏈:5'-GUGGGCCUUAUAUCAGUAUTT-3';反義鏈:5'-AUACUGAUAUAAGGCCCACTT-3'。HIWI上游引物:5'-AGAGGTTACCAGA CCAGAATGG-3'，下游引物:5'-GTGTGGGAGAAACACTACCACTT-3'，77 bp;GADPH上游引物:5'-CCACCCATGGCAAATTCCCATGGCA-3'，下游引物: 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'，597 bp。引物、RT-PCR試劑盒(Takara公司);siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000及TRIzol均購(gòu)自Invitrogen公司;瓊脂糖(西班牙Biowest)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌細(xì)胞系Eca-109培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中(調(diào)整濃度:1.5 g/L碳酸氫鈉、4.5 g/L葡萄糖、1.0 mmol/L丙酮酸鈉、10 mmol/L HEPES)，培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，不含抗生素，細(xì)胞于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞免疫熒光 用胰酶消化細(xì)胞后吹打均勻，每孔約4 000個(gè)細(xì)胞接種在24孔板上，5%CO2孵箱培養(yǎng)過夜;4%多聚甲醛固定10 min;Triton X-100作用15 min;5%BSA室溫封閉1 h;一抗?jié)窈?℃孵育過夜;二抗室溫避光孵育2 h;Herst室溫避光復(fù)染15 min。除用5%BSA封閉以后不用PBS清洗以外，其余步驟后面都用PBS洗3次，每次3 min;熒光照相，200倍鏡下觀察。

1.2.3 RNAi 轉(zhuǎn)染前1 d，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的食管癌細(xì)胞，按4×105個(gè)/孔接種于6孔板。5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細(xì)胞融合度達(dá)50%～ 80%時(shí)，應(yīng)用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按產(chǎn)品使用手冊(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔100 pmol siRNA、5 μL LipofectamineTM2000，其培養(yǎng)液終體積為2 mL。細(xì)胞在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)6 h后，將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基。無(wú)義siRNA作為陰性對(duì)照，單純LipofectamineTM2000作為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h分別收集細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)HIWI基因mRNA的表達(dá)水平變化。

1.2.4 RT-PCR 用TRIzol提取細(xì)胞總RNA后取5 μg按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)采用25 μL體系，94℃變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10 min，4℃保存。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，Gel-pro Analyzer軟件進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 細(xì)胞增殖變化 為觀察HIWI低表達(dá)后是否影響食管癌細(xì)胞的增殖，在96孔板中每孔接種6 000個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000作為轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以無(wú)義siRNA為陰性對(duì)照，單純的脂質(zhì)體為空白對(duì)照，轉(zhuǎn)染的濃度為25 nmol/L。在轉(zhuǎn)染24、48、72和96 h后應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，畫出細(xì)胞生存曲線，觀察降低HIWI轉(zhuǎn)錄后對(duì)細(xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果一致。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同組之間的均數(shù)比較采用單因素方差分析及兩兩比較分析用SNK檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIWI蛋白在食管癌細(xì)胞系Eca-109中的表達(dá)情況 HIWI陽(yáng)性反應(yīng)所發(fā)出的紅色熒光主要集中在細(xì)胞核，部分表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，少量陰性表達(dá)，細(xì)胞之間表達(dá)存在差異，見插頁(yè)Ⅲ圖11。

2.2 HIWI特異的 siRNA能降低食管癌細(xì)胞系Eca-109中HIWI轉(zhuǎn)錄 通過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HIWI特異siRNA組24、48、72、96 h后HIWI的表達(dá)均降低，其中48 h時(shí)結(jié)果最明顯(圖1)，結(jié)果分析最高抑制率能達(dá)到80%以上。

2.3 HIWI特異的siRNA降低HIWI在食管癌細(xì)胞系Eca-109中的表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HIWI特異siRNA組細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞增殖速度減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而3個(gè)對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢奌IWI轉(zhuǎn)錄降低后食管癌細(xì)胞增殖速度減慢，見圖2。

3 討論

圖1 HIWI siRNA對(duì)Eca-109細(xì)胞HIWI mRNA表達(dá)的影響注:1為只有脂質(zhì)體的空白對(duì)照組，2為無(wú)義siRNA陰性對(duì)照組，3為HIWI特異siRNA組

圖2 HIWI轉(zhuǎn)錄降低后對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖的影響注:M為只有脂質(zhì)體的空白對(duì)照組，C為無(wú)義siRNA陰性對(duì)照組，N為無(wú)處理組，S為HIWI特異siRNA組

進(jìn)一步研究食管癌的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)新的治療手段或提高現(xiàn)有治療方法的效率是我們的當(dāng)務(wù)之急。通過對(duì)CSCs學(xué)說的學(xué)習(xí)我們可以得到一個(gè)治療腫瘤的新思路，最近Lee等［3］也報(bào)道導(dǎo)致肝癌復(fù)發(fā)及產(chǎn)生化療抗藥性的元兇是一種癌干細(xì)胞，只要能夠抑制該干細(xì)胞，就可提升治療肝癌的效果，這一新研究發(fā)現(xiàn)可能為了解腫瘤形成和未來(lái)癌癥的治療帶來(lái)重大突破。

PIWI于1997年首先在果蠅的生殖干細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)［4］。PIWI家族在進(jìn)化中高度保守，并且在維持干細(xì)胞的自我更新、分化增殖，配子的發(fā)生發(fā)育和增殖，以及RNAi和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中都起著重要作用，是調(diào)節(jié)干細(xì)胞和生殖細(xì)胞的關(guān)鍵因子［5～7］。HIWI是PIWI于人類的同系物。SOX2、OCT4和HIWI三者皆為維持胚胎干細(xì)胞全能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要轉(zhuǎn)錄因子，有人研究發(fā)現(xiàn)SOX2、OCT4和HIWI均在食管癌中高表達(dá)。而Wang等［8］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SOX2和OCT4在食管癌中表達(dá)并影響食管鱗癌細(xì)胞的增殖、致瘤能力和耐藥性等。因此我們探討HIWI在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)有重要意義。

我們通過細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)到HIWI在食管癌細(xì)胞系Eca-109高表達(dá)，以核表達(dá)為主，少部分胞質(zhì)表達(dá)，有很少細(xì)胞陰性表達(dá)。這與何煒報(bào)道HIWI在食管癌組織中胞質(zhì)胞核均著色是一致的。HIWI是干細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，這說明看上去都一樣的食管癌細(xì)胞其實(shí)存在分化的不一致。因此我們推斷HIWI強(qiáng)陽(yáng)性的細(xì)胞可能就是傳說中的食管癌干細(xì)胞。

既然HIWI在食管癌細(xì)胞系Eca-109中高表達(dá)，那么我們可以假設(shè)，像在胚胎干細(xì)胞中所報(bào)道的那樣，HIWI可能與食管癌的增殖有關(guān)。為了驗(yàn)證我們的假設(shè)通過RNAi方法降低HIWI在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)，然后檢測(cè)HIWI低表達(dá)后食管癌細(xì)胞系Eca-109生長(zhǎng)曲線的變化，看其是否能夠減慢食管癌細(xì)胞的增殖速度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HIWI特異siRNA組的細(xì)胞在48和72 h增殖速度明顯慢于3個(gè)對(duì)照組，說明HIWI對(duì)食管癌細(xì)胞增殖起重要作用。我們推測(cè)腫瘤就是由于各種原因提高了 HIWI、SOX2、OCT4和NANOG等干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，使得腫瘤表現(xiàn)出來(lái)的增殖失控。通過降低這些基因的轉(zhuǎn)錄可以作為腫瘤治療的新手段。

綜上所述，通過本實(shí)驗(yàn)研究我們發(fā)現(xiàn)HIWI在食管癌細(xì)胞系Eca-109中高表達(dá)，并且存在差異;通過RNAi技術(shù)降低HIWI的表達(dá)后能夠減慢食管癌細(xì)胞的增殖速度。本研究的結(jié)果是對(duì)CSCs學(xué)說的支持，也為食管癌的靶向治療提供基礎(chǔ)研究，為根治食管癌帶來(lái)新的希望。

［1］Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］.Nature，2001，414(6859):105-111.

［2］He W，Wang Z，Wang Q，et al.Expression of HIWI in human esophageal squamous cell carcinoma is significantly associated with poorer prognosis［J］.BMC Cancer，2009，9:426.

［3］Lee TK，Castilho A，Cheung VC，et al.CD24(+)liver tumor-initiating cells drive self-renewal and tumor initiation through STAT3-mediated NANOG regulation［J］.Cell Stem Cell，2011，9(1): 50-63.

［4］Lin H，Spradling AC.A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary［J］.Development，1997，124(12):2463-2476.

［5］Hutvagner G，Simard MJ.Argonaute proteins:key players in RNA silencing［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(1):22-32.

［6］Liu X，Sun Y，Guo J，et al.Expression of hiwi gene in human gastric cancer was associated with proliferation of cancer cells［J］.Int J Cancer，2006，118(8):1922-1929.

［7］Seto AG，Kingston RE，Lau NC.The coming of age for Piwi proteins［J］.Mol Cell，2007，26(5):603-609.

［8］Wang Q，He W，Lu C，et al.Oct3/4 and Sox2 are significantly associated with an unfavorable clinical outcome in human esophageal squamous cell carcinoma［J］.Anticancer Res，2009，29(4):1233-1241.