楊 春，陳 文，鐘曉琳，王忠瓊，陳 楓，夏紀(jì)毅

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州64600)

HCV感染是全球流行疾病，與原發(fā)性肝癌(HCC)關(guān)系密切［1］。丙型肝炎非結(jié)構(gòu)蛋白 4B (HCV-NS4B)是HCV的一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，其功能到目前為止仍舊還不是很清楚［2］。相關(guān)研究顯示NS4B蛋白在HCV感染細(xì)胞的惡性變中起重要作用［3］。我們前期研究證實(shí)HCV-NS4B促進(jìn)肝細(xì)胞增殖［4］，還發(fā)現(xiàn)HCV-NS4B可激活原癌基因如c-myc等在肝細(xì)胞的表達(dá)［5］，提示HCV-NS4B在丙型肝炎致癌機(jī)制中可能起一定作用。而關(guān)于HCVNS4B蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制的研究國(guó)內(nèi)外未有報(bào)道。2010年2月～2011年3月，本研究采用HCV-NS4B表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將NS4B導(dǎo)入肝癌細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響，以及其對(duì)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和周期素D1(cyclinD1)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，PCXN2-NS4B質(zhì)粒為李昌平教授構(gòu)建并保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及鑒定 HepG2細(xì)胞分為3組:空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染的 HepG2細(xì)胞)，空白載體組(PCXN2轉(zhuǎn)染組)，PCXN2-NS4B轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d以2×105/mL接種于6孔板，37℃，5%CO2培養(yǎng);待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)60%～80%匯合，加入以1.5 μg/4 μg配制質(zhì)粒/脂質(zhì)體混合物(DOSPER脂質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司)，空白對(duì)照組加入等體積無(wú)血清培養(yǎng)基。24 h后加入800 mg/mL G418(購(gòu)自上海Sangon公司)篩選，待空白對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后，G418減量為200 mg/L維持篩選并傳代培養(yǎng)。

采用TRIzol試劑(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)一步法提取HepG2細(xì)胞總RNA。使用NS4B特異性的反向引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA作為模板，加入GoTaq DNA多聚酶、NS4B特異性的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物:正義鏈5'-CCGCTCGAGTTAGCATGGCGTGGAGCAGTCCT-3'，反 義 鏈 5'-CCGCTCGAGACCATGGCCTCACACCTCCCTTACAT-3'(RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)。RT-PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定是否轉(zhuǎn)染成功。

1.2.2 MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞以胰蛋白酶消化，1×103/孔接種于96孔板，各接種5復(fù)孔，共接種7個(gè)板，以完全培養(yǎng)基作為空白調(diào)零孔，每天取1個(gè)96孔板檢測(cè)。待檢測(cè)板每孔加入MTT液(購(gòu)自上海Sangon公司)5 mg/mL，20 μL于37℃，5%CO2培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜。490 nm波長(zhǎng)測(cè)光密度值(OD值)，每個(gè)標(biāo)本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞以胰蛋白酶消化，2 000 r/min離心5 min，PBS重懸細(xì)胞2次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為(1～2)×105/mL，取1 mL置于流式上機(jī)管中檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.4 PCNA、cyclinD1蛋白表達(dá)的檢測(cè) 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè):轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞以胰蛋白酶充分消化。1×105傳代于預(yù)置玻片(經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理)的6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。固定沖洗細(xì)胞爬片，抗原修復(fù)，10%正常山羊血清封閉，再逐步滴加一抗、生物素標(biāo)記二抗、鏈霉抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶溶液，最后經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。陰性對(duì)照除了用PBS代替一抗外，所有步驟同上。每組細(xì)胞各進(jìn)行6次獨(dú)立性實(shí)驗(yàn)。(鼠抗人PCNA單克隆抗體和鼠抗人cyclinD1單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司;DAB顯色劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)。

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判定:陽(yáng)性呈棕黃色顆粒定位于胞質(zhì)，采用OLYMPUS BX50生物顯微高清晰度彩色病理圖文采集系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)測(cè)定免疫細(xì)胞化學(xué)陽(yáng)性產(chǎn)物OD值。每張爬片在100倍視野下隨機(jī)測(cè)5個(gè)視野，取其均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，多組間兩兩均數(shù)比較采用SNK法，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因轉(zhuǎn)染及鑒定 PCXN2-NS4B組有HCVNS4B表達(dá)，表明基因轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞后，可穩(wěn)定表達(dá)NS4B，見(jiàn)圖1。

圖1 PCXN2-NS4B轉(zhuǎn)染組RT-PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳圖

2.2 NS4B對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響 轉(zhuǎn)染PCXN2-NS4B后，HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)速度較空白載體組增快(圖2)。

圖2 HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 NS4B對(duì)肝細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 見(jiàn)表1。

2.4 NS4B對(duì)PCNA、cyclinD1蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表2，插頁(yè)Ⅱ圖6、7。

表1 HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期情況(±s)

表1 HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期情況(±s)

注:與空白載體組及空白對(duì)照組比較，*P＜0.05

?

表2 PCNA及cyclinD1蛋白在HepG2細(xì)胞表達(dá)OD值(±s)

表2 PCNA及cyclinD1蛋白在HepG2細(xì)胞表達(dá)OD值(±s)

注:與空白載體組及空白對(duì)照組比較，*P＜0.05

?

3 討論

細(xì)胞異常增殖是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一，腫瘤細(xì)胞的增殖率是決定腫瘤生物學(xué)行為的一個(gè)重要參數(shù)［6］。我們將外源性 HCV-NS4B基因?qū)際epG2細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期顯示，轉(zhuǎn)染NS4B的肝癌細(xì)胞進(jìn)入靜止期的細(xì)胞減少，而S期和G2/M期顯著增多，表明肝癌細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，提示HCV-NS4B可能通過(guò)某種機(jī)制刺激細(xì)胞DNA合成，細(xì)胞進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。HCVNS4B主要作用包括抑制翻譯，調(diào)節(jié)NS4B RNA依賴(lài)的RNA聚合酶的活性，引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)細(xì)胞非折疊蛋白反應(yīng)等［7～9］。研究發(fā)現(xiàn)NS4B蛋白還能夠激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)［10］。我們前期研究亦證實(shí)HCV-NS4B可通過(guò)增進(jìn)細(xì)胞周期素cyclinD1、PCNA表達(dá)，干擾肝細(xì)胞周期，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖［4］。還發(fā)現(xiàn)HCV-NS4B可激活原癌基因如c-myc等在肝細(xì)胞的表達(dá)［5］。而本研究進(jìn)一步提示HCV-NS4B對(duì)肝癌細(xì)胞亦有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

細(xì)胞周期受多種蛋白調(diào)節(jié)。PCNA是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，直接參與細(xì)胞增殖的DNA復(fù)制［11］。作為一個(gè)內(nèi)源性增殖細(xì)胞的標(biāo)記物，與腫瘤的增長(zhǎng)活性、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切關(guān)系，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞的多少能反映腫瘤生長(zhǎng)速度及惡性程度，預(yù)示腫瘤轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)及患者的存活時(shí)間［12］。cyclinD1是細(xì)胞周期G1/S期監(jiān)控點(diǎn)重要的正向調(diào)控因子，其通過(guò)激活細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶，進(jìn)而活化下游的信號(hào)分子促進(jìn)DNA合成，加快細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而導(dǎo)致細(xì)胞失控性生長(zhǎng)［13］，與多種腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染NS4B的肝癌細(xì)胞PCNA及cyclinD1表達(dá)均明顯增強(qiáng)，提示HCV-NS4B蛋白可能促進(jìn)PCNA及cyclinD1表達(dá)，促使更多細(xì)胞越過(guò)G1/S期監(jiān)控點(diǎn)而進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖，參與肝癌的發(fā)生。

［1］Stankovic-Djordjevic D，Djordjevic N，Tasic G，et al.Hepatitis C virus genotypes and the development of hepatocellular carcinoma［J］.J Dig Dis，2007，8(1):42-47.

［2］Gouttenoire J，Penin F，Moradpour D.Hepatitis C virus nonstructural protein 4B:a journey into unexplored territory［J］.Rev Med Virol，2010，20(2):117-129.

［3］Levrero M.Viral hepatitis and liver cancer:the case of hepatitis C［J］.Oncogene，2006，25(27):3834-3847.

［4］楊春，李昌平，陳楓，等.丙型肝炎病毒NS4B對(duì)肝細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2008，29(1):59-61.

［5］陳霞，李昌平，徐建玉，等.丙型肝炎病毒NS4B對(duì)肝細(xì)胞c-myc和ras蛋白表達(dá)的影響［J］.腫瘤防治研究，2006，33(10): 736-738.

［6］Davis CD，Emenaker NJ，Milner JA.Cellular proliferation，apoptosis and angiogenesis:molecular targets for nutritional preemption of cancer［J］.Semin Oncol，2010，37(3):243-257.

［7］Paul D，Romero-Brey I，Gouttenoire J，et al.NS4B self-interaction through conserved C-terminal elements is required for the establishment of functional hepatitis C virus replication complexes［J］.J Virol，2011，85(14):6963-6976.

［8］Aligo J，Jia S，Manna D，et al.Formation and function of hepatitis C virus replication complexes require residues in the carboxy-terminal domain of NS4B protein［J］.Virology，2009，393(1):68-83.

［9］Li S，Ye L，Yu X，et al.Hepatitis C virus NS4B induces unfolded protein response and endoplasmic reticulum overload response-dependent NF-kappaB activation［J］.Virology，2009，391(2): 257-264.

［10］Kato N，Yoshida H，Ono-Nita SK，et al.Activation of intracellular signaling by hepatitis B and C viruses:C-viral core is the most potent signal inducer［J］.Hepatology，2000，32(2):405-412.

［11］Naryzhny SN.Proliferating cell nuclear antigen:a proteomics view［J］.Cell Mol Life Sci，2008，65(23):3789-3808.

［12］Sarafoleanu D，Postelnicu V，Iosif C，et al.The role of p53，PCNA and Ki-67 as outcome predictors in the treatment of laryngeal cancer［J］.J Med Life，2009，2(2):219-226.

［13］Malumbres M.Physiological relevance of cell cycle kinases［J］.Physiol Rev，2011，91(3):973-1007.