陳智嘉，谷 勵，王景龍，陳思嘉

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，吉林長春 130021;2.吉林省臨江市醫(yī)院，吉林 臨 江 134600;3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院11所，吉林 長春 130122)

乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，近年發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡也趨于年輕化。近年來研究發(fā)現(xiàn)As2O3不僅對APL細胞，而且對其他血液腫瘤細胞［1－2］和許多實體瘤細胞均具有誘導(dǎo)凋亡作用［3－4］。Wang 等［5］研究表明端粒酶與惡性腫瘤發(fā)生有著緊密的關(guān)聯(lián)，p21特異性核苷酸序列能夠抑制端粒酶的活性，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。也許端粒酶的活性指標(biāo)在治療惡性腫瘤的過程能提供新的策略。

本實驗對As2O3對乳腺癌細胞的抑制作用及在不同濃度下端粒酶活性的變化進行了研究。以期為治療乳腺癌的過程中提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與細胞株 純試劑As2O3購自美國Sigma公司，配成(1 mmol·L－1)，溶于 PBS 液，凍存;RPMI 1640、胎牛血清(FBS)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰酶實驗耗材等購自Gibco公司;DMSO(生工生物);RT-PCR kit寶生物工程(大連)有限公司;其他試劑均由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實驗室提供。人乳腺癌細胞MCF-7株購自中科院上海細胞生物學(xué)研究所，本室自己傳代保存。

1.2 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)細胞采用開放式單層貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)液為RPMI 1640(含10%小牛血清，青霉素100 kU·L－1，鏈霉素 1 00 mg·L－1)，培養(yǎng)條件為 3 7℃，5%CO2，相對飽和濕度。每日觀察生長情況，貼壁2～5 d傳代1次。傳代時用0.25%胰酶消化后，加入培養(yǎng)液吹打制成細胞懸液，繼續(xù)傳代，并取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 MTT法 取對數(shù)生長期的MCF-7細胞系，制成每升約含有1×108個單細胞懸液。分別接種于96孔板，每孔加細胞懸液100 μl，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h后。將實驗分6組即對照組和5給藥組，按分組情況分別加入(0.5，0.8，1.0，1.5 和2.0 μmol·L－1)的 A s2O3，每個濃度設(shè) 5 個復(fù)孔，每孔終體積200 μl，培養(yǎng)48 h后，每孔加入50 μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO，充分振蕩10 min，于酶標(biāo)儀上檢測490 nm處吸光度值。計算細胞成活率/%=(實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值)×100%。

1.4 抑制端粒末端轉(zhuǎn)移酶的活性 依據(jù)PCR-ELISA方法平均值來測定端粒末端轉(zhuǎn)移酶的活性，首先培養(yǎng)收集對數(shù)生長期的MCF-7細胞系加入終濃度分別為(0.5、0.8、1.0、1.5和2.0 μmol·L－1)的 A s2O3，每個濃度設(shè) 5 個復(fù)孔，培養(yǎng) 2 4 h后進行裂解細胞通過PCR-ELISA方法測定其平均值。同時加入1.5 μmol·L－1的 A s2O3后分別培養(yǎng)24、48 和72 h 后測定其平均值。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法測定As2O3對細胞存活率的影響 通過MTT法測定發(fā)現(xiàn):與對照組比，給藥組的細胞存活率隨著As2O3的濃度的增加明顯呈現(xiàn)劑量依賴性降低。其中給藥濃度為2.0 μmol·L－1，細胞的存活率為(41.69 ± 0 .25)%(P＜0.01)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義?？梢宰鳛橐种瓢┘毎鲋车膮⒖紨?shù)據(jù)。

2.2 端粒酶活性的變化 端粒酶是一種能延長端粒末端的核糖核酸蛋白酶，通過延長端粒DNA從而阻滯因端粒酶縮短而誘發(fā)的細胞衰老，使細胞具有無限增殖能力。因此，端粒酶與腫瘤的惡性進展密切相關(guān)。按照說明書進行端粒酶活性檢測，在酶標(biāo)儀中得到端粒酶的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。與對照組組相比，當(dāng) As2O3達到 1.5、2.0 μmol·L－1時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。當(dāng) As2O3濃度為1.5 mmol·L－1，時間達72 h時As2O3抑制端粒酶的活性經(jīng)PCR-ELISA方法檢測均具有時間－濃度的依賴性結(jié)果，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

As2O3作為我國傳統(tǒng)中藥，在治療急性早幼粒細胞白血病過程取得了明顯的療效。近年來研究表明As2O3能夠誘導(dǎo)多種癌細胞的凋亡，諸如急性早幼粒白細胞、骨髓癌細胞、神經(jīng)瘤細胞、食道癌細胞、前列腺癌細胞、胃癌細胞、惡性腎腫瘤細胞、卵巢癌細胞、喉癌細胞。對(1)通過MTT法測定As2O3對細胞存活率的影響;(2)通過PCR-ELISA方法測定端粒酶活性的變化;端粒酶是一種能延長端粒末端的核糖核酸蛋白酶，能在多種腫瘤中高表達，而在良性和正常組織中低表達，是腫瘤預(yù)后和重要的抗腫瘤靶點［6］。據(jù)最近研究報道端粒酶在不同的細胞周期階段發(fā)揮著重要的作用，尤其在細胞G0/G1活性明顯增強［7］。通過用PCR-ELISA法測定經(jīng)As2O3處理過的乳腺癌細胞端粒酶活性的變化，我們發(fā)現(xiàn)隨著As2O3的濃度和反應(yīng)時間上的不斷增加，端粒酶的活性不斷降低。因此推斷As2O3能抑制乳腺癌細胞端粒酶活性在時間－濃度均呈依賴性，這為As2O3在治療乳腺癌的實踐中提供理論依據(jù)。

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