張 培， 劉志輝， 王 彬， 李 健

缺血性腦血管病已成為世界上發(fā)病率最高，并嚴重危害人類健康及生活質(zhì)量的疾病之一，而且隨著老齡化社會的到來，其發(fā)病率、致殘率、致死率有逐年增高的趨勢。腦缺血損傷是一個復(fù)雜的病理過程，而缺血再灌注損傷對腦組織損傷更大，危害更大。已有研究表明適度的飲酒對冠心病起到一定的防治作用，國外有研究顯示腦梗死后一次性給予相對大劑量的酒精對腦損傷有治療作用。目前國內(nèi)關(guān)于酒精對急性腦梗死的治療作用研究很少，對其作用機制的研究幾乎為零。本實驗研究大鼠缺血再灌注后一次性給予相對大劑量酒精的治療作用，并進一步研究其治療機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性成年Wistar大鼠40只，體重在330～380g，由濰坊醫(yī)學(xué)院動物中心提供。

1.1.2 實驗器材 干棉球、酒精棉球、10%水合氯醛+注射器、碘伏+棉簽、3種不同粗細的魚線(魚線在2.0、2.5mm處各用記號筆作好標記，便于觀察進入距離)、彎盤、手術(shù)器材、記號筆、玻璃分針。

1.1.3 實驗試劑 50%酒精，GLUT-1兔多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，SABC免疫組化染色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 將40只健康雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組(A組)，對照組(B組)，酒精1.0g/kg、1.5g/kg、2.0g/kg 組(C 組，分別為 C1、C2、C3組)，共5組，每組8只，再將每組按時間分為0h、1h、2h、3h 4 組，分別于缺血-再灌注后即刻、1h、2h、3h腹腔注射酒精。所有大鼠均于缺血-再灌注后及酒精干預(yù)后行Longa評分，缺血再灌注后24h取腦，用免疫組化法檢測GLUT-1表達陽性細胞數(shù)。

1.2.2 模型制備 根據(jù)Nagasawa等改良的線栓法制作大鼠中動脈缺血再灌注損傷模型。用10%水合氯醛按0.3ml/kg腹腔麻醉大鼠后，將其仰臥固定，頸正中切口，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)及頸外動脈(ECA)，結(jié)扎ECA與CCA，用動脈夾夾閉CCA遠心端后，迅速于ECA與ICA分叉下方剪一切口，將0.26mm單絲尼龍魚線頭端0.5cm用石蠟包被，并于20mm長處標記，全部大鼠均通過右側(cè)CCA切口處插入，插入深度為20～25mm，直到有輕微阻力感為止，實現(xiàn)大腦中動脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。結(jié)扎入口處，尼龍線外留約1 cm，縫合皮膚。2h后輕輕取出線栓，實現(xiàn)缺血再灌注，造模完成。動物清醒后，出現(xiàn)Horner征，提尾右前肢屈曲或爬行向左側(cè)轉(zhuǎn)圈者為手術(shù)成功標志。A組除插線1cm外，其余步驟同模。

1.2.3 神經(jīng)功能評分 所有大鼠經(jīng)線栓法造模清醒后行Longa 5分評分，1～3分納入實驗。然后按照時間注射相應(yīng)劑量的酒精，取腦前再次行Longa 5分評分，比較前后兩次評分的差別。

1.2.4 C 組大鼠缺血-再灌注后即刻、1h、2h、3h腹腔注射不同劑量酒精，B組大鼠注射等劑量生理鹽水。

1.2.5 標本制備及陽性細胞測定 將造模成功大鼠于再灌注后24h取材，大鼠用10%水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，分離左側(cè)頸總動脈，剪開股動脈，經(jīng)左側(cè)頸總動脈灌注生理鹽水300ml、4%多聚甲醛300ml，斷頭取腦，于視交叉前后取材，取厚約3mm冠狀腦片，經(jīng)充分固定脫水透明后石蠟包埋做連續(xù)切片，厚度為5μm，采用免疫組化法檢測GLUT-1表達陽性細胞數(shù)，免疫組化按照試劑說明書進行，在光鏡下觀察陽性細胞，光鏡下GLUT-1免疫陽性細胞胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色，于400倍物鏡下分別計數(shù)海馬區(qū)5個不同視野的陽性細胞數(shù)，取其均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評分 A組大鼠無局灶性體征，神經(jīng)功能評分為0分。B組和C組大鼠在缺血后出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能障礙，神經(jīng)功能評分分別為3.63 ±0.64、3.38 ±0.80，兩組間比較無明顯差別(P=0.688)，再灌注后24h B組和C組神經(jīng)功能評分分別為 3.63 ±0.74 和 1.89 ±0.74，兩組間比較有明顯的差異(P=0.019)。C1、C2、C3 3 組神經(jīng)功能評分分別為 2.87 ± 0.64、2.38 ± 0.74、1.50 ±0.53，C1 與 C2 間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.172);C2與C3組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.017);C1與C3組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.001)。其中，C3組癥狀改善最明顯，神經(jīng)功能評分降低最明顯。

2.2 大鼠海馬區(qū)GLUT-1表達 B組與C組大鼠海馬區(qū)GLU-1表達陽性細胞數(shù)分別為18.65±4.00和 36.93 ±12.39，C 組明顯高于 B 組(P=0.002)，C1、C2、C3 3 組海馬區(qū) GLU-1 表達陽性細胞數(shù)分別為 25.95 ± 5.85、44.00 ± 12.95、40.85 ±8.89，C1與C2組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0);C2與C3組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.375);C1與C3組比較存在統(tǒng)計學(xué)差異(P=0)。C2與C3組大鼠海馬區(qū)GLUT-1表達陽性細胞數(shù)明顯高于C1組，C2組與C3組比較無明顯差異。

2.3 不同治療時間酒精組大鼠海馬區(qū)GLUT-1表達的陽性細胞數(shù) C組大鼠分別在缺血-再灌注后即刻、1h、2h、3h給予腹腔注射不同劑量酒精，各時間組間比較，其中0h與1h組間比較，P=0.750，1h與2h組間比較，P=0.175，2h與3h組間比較，P=0.119，0h 與 3h 組間比較，n=0.359。各時間組海馬區(qū)GLUT-1表達陽性細胞數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(均P ＞0.05)。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一復(fù)雜的病理生理過程，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋-1(glucose transporter 1，GLUT-1)是腦內(nèi)兩大主要葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白之一，主要負責(zé)除神經(jīng)元以外腦大部分葡萄糖的轉(zhuǎn)運，它主要分布于血腦屏障微血管內(nèi)皮細胞，是血液葡萄糖進入腦內(nèi)的門戶，其表達量的多少直接反映了腦攝取利用葡萄糖的能力［1］。腦是全身器官中代謝率最高、需要能量最多的器官，但是腦組織本身不具有儲存能量的功能，所需能量主要由血液通過血腦屏障提供葡萄糖代謝產(chǎn)能提供，而葡萄糖要通過血腦屏障，必須依賴一些存在于血腦屏障微血管內(nèi)皮細胞上的載體，而GLUT-1就是其中最重要的一個。腦缺血缺氧后，梗死組織主要依靠葡萄糖無氧酵解提供能量，而葡萄糖無氧酵解提供的能量僅為有氧代謝的十分之一，遠遠不能滿足腦組織需求量，為增加供能，只能通過大量攝取葡萄糖進入腦組織，而這一過程也需要GLUT-1，GLUT-1含量越多，腦組織中葡萄糖越多，供能越多，損傷越輕，反之亦然。

酒精(乙醇，Ethanol)，是由淀粉或糖類經(jīng)發(fā)酵釀造而成。大量飲酒可增加腦血管病的發(fā)病率。適量飲酒可以減少腦血管病的發(fā)病率，主要是通過提高纖維蛋白原的活性、改變脂質(zhì)組成結(jié)構(gòu)、炎性因子、血管擴張、血管內(nèi)皮因子、胰島素活性以及脂肪細胞因子(adipokines)［2～9］的多少來發(fā)揮作用。

本研究主要是探討酒精對糖酵解是否存在影響來探討其機制，在研究中，酒精治療后大鼠神經(jīng)功能明顯改善，可見酒精對急性缺血-再灌注大鼠有治療作用，GLUT-1表達陽性細胞數(shù)增加，提示酒精可增加腦部糖酵解提供能量來發(fā)揮作用，對酒精1.0g/kg、1.5g/kg、2.0g/kg 3 組間比較發(fā)現(xiàn)，2.0g/kg 酒精組癥狀改善最明顯，GLUT-1表達陽性細胞數(shù)增加最明顯，1.5g/kg與2.0g/kg酒精組 GLUT-1表達陽性細胞數(shù)基本相同。進一步對梗死后0h、1h、2h、3h給藥進行比較，發(fā)現(xiàn)各時間之間GLUT-1表達陽性細胞數(shù)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。提示相對大劑量的酒精對其治療作用較顯著，而缺血-再灌注后3h內(nèi)給藥均有效果。

本研究也存在一些缺點，酒精的作用是多方面多機制的，第一，本實驗僅研究使用酒精后1個因子的變化情況，對其它因子的變化及作用機制沒有研究，研究尚不全面，需要進一步的研究;第二，以往有很多研究證明長期飲酒對人體是有害的，可以增加腦血管病的發(fā)病率，而且很多人不能耐受酒精造成的副作用，所以目前尚不能應(yīng)用于臨床腦血管病的治療工作中。

［1］Vos PE，Lamers KJ，Hendriks JC，et al.Glial and neuronal proteins in seruln predict outcome after severe traumatic brain injury［J］.Neurology，2004，62(8):130-131.

［2］Hendriks HF，Veenstra J，Velthuis TE，et al.Effect of moderate dose of alcohol with evening meal on fibrinolytic factors［J］.BMJ，1994，30(8):1003-1006.

［3］Rakic V，Puddey IB，Dimmitt SB，et al.A controlled trial of the effects of pattern of alcohol intake on serum lipid levels in regular drinkers［J］.Atherosclerosis，1998，13(7):243-252.

［4］Sierksma A，Kluft C，Kluft C，et al.Moderate alcohol consumption reduces plasma C-reactive protein and fibrinogen levels.A randomized，diet-controlled intervention study［J］.Eur J Clin Nutr，2002，56:1130-1136.

［5］Hashimoto M，Kim S，Eto M，et al.Effect of acute intake of red wine on flow-mediated vasodilatation of the brachial artery［J］.Am J Cardiol，2001，88:1457-1460.

［6］Vlachopoulos C，Tsekoura D，Eto M，et al.Effect of alcohol on endothelial function in healthy subjects［J］.Vasc Med，2003，8:263-265.

［7］Sacanella E，Vazquez-Agell M，Mena MP，et al.Down-regulation of adhesion molecules and other inflammatory biomarkers after moderate wine consumption in healthy women:a randomized trial［J］.Am J Clin Nutr，2007，86:1463-1469.

［8］Beulens JW，de Zoete EC，Kok FJ，et al.Effect of moderate alcohol consumption on adipokines and insulin sensitivity in lean and overweight men:a diet intervention study［J］.Eur J Clin Nutr，2008，62:1098-1105.

［9］Shai I，Rimm EB，Schulze MB，et al.Moderate alcohol intake and markers of inflammation and endothelial dysfunction among diabetic men［J］.Diabetologia，2004，47:1760-1767.