許 靜， 劉志安， 高殿帥

臨床及流行病學(xué)研究已表明，腦卒中的病因絕大多數(shù)是動(dòng)脈粥樣硬化引起，高密度脂蛋白-膽固醇具有抗動(dòng)脈硬化的作用。臨床資料表明高密度脂蛋白在缺血性腦卒中患者明顯降低，其保護(hù)因素降低可能是卒中發(fā)生的原因之一［1，2］。從病因?qū)W角度研究高密度脂蛋白受體在治療腦卒中方面具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

S1P受體是眾多高密度脂蛋白受體的一種，其激活后可以產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如抑制細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、調(diào)節(jié)粘附分子表達(dá)等。S1P受體激活的抗凋亡作用在心肌、腎臟等組織缺血中研究較多［3，4］，在腦缺血中的作用則少有報(bào)道，其機(jī)制更不甚清楚。本研究的目的是探討S1P受體激動(dòng)劑FTY720對(duì)全腦缺血復(fù)灌的神經(jīng)保護(hù)作用，以及其是否通過(guò)激活CaMKK/Akt信號(hào)通路而發(fā)揮保護(hù)作用，為腦缺血的臨床治療提供新的策略和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，250～280g，清潔級(jí)，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組(每組n=8):假手術(shù)組(sham組)、缺血/再灌注1d組(I/R組)、I/R+FTY720給藥組(F組)、I/R+STO-609給藥組(S組)及I/R+溶劑DMSO對(duì)照組(D組)。

1.1.2 試劑 p-Akt(S473)及 Akt兔多克隆抗體 (Cell Signal公司);抗CaMKK多克隆抗體、羊抗兔單克隆抗體 (Santa Cruz公司);FTY720(Cayman公司);STO-609(Sigma公司);NBT/BCIP(Promega公司提供);BCA蛋白定量試劑(碧云天生物技術(shù)研究所);TUNEL試劑盒(北京中杉金橋生物公司)，其它常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 動(dòng)物以20% 水合氯醛(300～350mg/kg)腹腔注射麻醉后制作四動(dòng)脈結(jié)扎全腦缺血模型。全腦缺血15min、再灌注1d后行凋亡和免疫印記檢測(cè)。缺血前大鼠處于清醒狀態(tài)，其生命體征完全正常。缺血時(shí)保持其直腸溫度在36.5℃ ～37.5℃之間。缺血后30～60s內(nèi)以翻正反射消失、四肢僵直、同時(shí)痛覺(jué)消失、雙側(cè)瞳孔散大等體征表現(xiàn)判斷缺血模型的可靠性。假手術(shù)組處理同實(shí)驗(yàn)組，但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。

1.2.2 給藥 FTY720以0.5mg/ml的濃度溶于1%DMSO，于缺血前30min以1mg/kg腹腔注射;STO-609以1μg/μl的濃度溶解于1%DMSO，利用微量注射器通過(guò)側(cè)腦室于FTY720給藥后20min注射(從前囟后開(kāi)0.8毫米、旁開(kāi)1.5毫米、深3.5毫米)，每只大鼠給藥10μl，10min內(nèi)注完。注射同體積的DMSO作為陰性對(duì)照。

1.2.3 蛋白樣品制備 大鼠缺血15min再灌注1d后，快速斷頭取海馬，分區(qū)，取CA1區(qū)置液氮中凍存?zhèn)溆?。使用時(shí)從液氮中取出海馬加冰冷的勻漿緩沖液勻漿，高速勻漿(10s×6次)，4℃下1000g離心15min去除沉淀物收集上清樣品。

1.2.4 蛋白含量測(cè)定 采用BCA蛋白定量試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5 凋亡檢測(cè)(TUNEL染色) 各組動(dòng)物以4℃預(yù)冷生理鹽水、40g/L多聚甲醛行心臟灌注，斷頭取腦，在視交叉前后1.5mm處冠狀切片取材，常規(guī)固定、脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，采用Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作行TUNEL染色。

1.2.6 免疫印跡(IB) 等量蛋白樣品經(jīng)10%SDS-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，以濕轉(zhuǎn)或半干轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至NC膜上。轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)3%BSA封閉后加入不同的稀釋后的一抗，4℃過(guò)夜。用洗滌液洗膜，加入相應(yīng)的二抗，室溫反應(yīng)2h。洗膜后以NBT/BCIP顯色，結(jié)果以Image圖像分析軟件處理。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析采用方差分析(ANOVA)，多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組比較用最小顯著差法(LSD)，實(shí)驗(yàn)組之間比較采用 q檢驗(yàn)(Newman-keuls test)，P ＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異。

2 結(jié)果

2.1 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡 缺血復(fù)灌1d后的凋亡細(xì)胞顯示不規(guī)則形，褐色深染(見(jiàn)圖1)。假手術(shù)組未見(jiàn)凋亡細(xì)胞，缺血復(fù)灌1d后引起嚴(yán)重細(xì)胞凋亡，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為118.8±12.4;給予FTY720后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為55.9±8.1，較I/R組凋亡細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)，保護(hù)作用達(dá)到50.4%左右;STO-609組凋亡細(xì)胞數(shù)(90.7±10.5)較FTY720組明顯增多(P＜0.05)。

2.2 各組CaMKK表達(dá)水平、Akt磷酸化水平給予FTY720后(見(jiàn)表1、圖2)，CaMKK免疫印記灰度值為 2.247 ±0.239，p-Akt灰度值為 2.405 ±0.265，較 I/R 組明顯升高(P ＜0.05);而 STO-609組 CaMKK 灰度值為1.294 ±0.130，p-Akt灰度值為1.153 ±0.144，較 FTY720 組明顯降低(P ＜0.05);各組Akt表達(dá)水平無(wú)明顯變化，溶劑對(duì)照組CaMKK表達(dá)和Akt磷酸化水平亦無(wú)明顯變化。

3 討論

S1P受體有5種類(lèi)型即S1P1～S1P5，其表達(dá)具有一定組織特異性。在哺乳動(dòng)物的大腦中表達(dá)的主要是S1P1～S1P3受體，激動(dòng)劑為FTY720，其抗凋亡作用在心肌缺血中研究較多，在腦缺血損傷中的作用不甚清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，局灶缺血再灌注后大鼠梗死灶周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)S1P1的蛋白表達(dá)水平明顯升高，再灌注后3h、12h 達(dá)到高峰，24h 開(kāi)始下降［5］;在細(xì)胞水平上，F(xiàn)TY720可以減少谷氨酸導(dǎo)致的小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡［6］;最新研究表明FTY720激活S1P受體顯著縮小局灶腦缺血梗死體積，改善神經(jīng)功能評(píng)分，減少了凋亡細(xì)胞數(shù)量［7］。以上研究結(jié)果提示FTY720激活S1P受體后在腦缺血中發(fā)揮重要抗凋亡作用。本研究發(fā)現(xiàn)給予FTY720可以顯著降低I/R導(dǎo)致的凋亡細(xì)胞數(shù)，進(jìn)一步證實(shí)了FTY720在腦缺血中的神經(jīng)保護(hù)作用，但是具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。

S1P受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，S1P受體與Gq偶聯(lián)［8］引起胞內(nèi)鈣庫(kù) Ca2+釋放。有研究表明 S1P與其受體結(jié)合后，胞內(nèi)Ca2+釋放激活了Ca2+/CaM依賴(lài)的蛋白激酶的激酶 CaMKK從而Akt激活，減輕了內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙［9］，這說(shuō)明S1P受體介導(dǎo)的內(nèi)源性Ca2+釋放可能起著抗凋亡的作用。長(zhǎng)期以來(lái)，在Akt信號(hào)通路的研究中，一般認(rèn)為Akt的激活是由PI-3K直接介導(dǎo)的，研究的重點(diǎn)主要集中在PI-3K及其上游激酶上。有研究報(bào)道胞內(nèi)Ca2+濃度下降或是鈣調(diào)蛋白CaM功能缺失會(huì)嚴(yán)重影響一些生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的Akt活化和神經(jīng)元的存活［10］;在細(xì)胞水平上CaMKK可以直接激活A(yù)kt［11，12］，使其T308和S473位磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞的存活;另有報(bào)道腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子激活大鼠海馬原代神經(jīng)元上表達(dá)的 CaMKK，進(jìn)而激活 Akt［13］。這些研究表明CaMKK在Akt激活過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Yano等［14］將CaMKK和Akt共轉(zhuǎn)染于COS7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Akt被磷酸化而激活，隨后在豚鼠預(yù)缺血模型中發(fā)現(xiàn)Akt磷酸化水平較缺血組升高，CaMKK作為Akt的上游激酶發(fā)揮拮抗缺血性損傷的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)FTY720顯著提高大鼠I/R過(guò)程中海馬神經(jīng)元CaMKK的表達(dá)和Akt的磷酸化水平，而CaMKK的抑制劑STO-609則逆轉(zhuǎn)了這種作用;TUNEI檢測(cè)結(jié)果也表明給予STO-609后凋亡細(xì)胞數(shù)較FTY720組明顯增多，說(shuō)明FTY720可能通過(guò)激活CaMKK/Akt信號(hào)通路發(fā)揮其在腦缺血損傷中的抗凋亡作用。

綜上所述，S1P受體激動(dòng)劑FTY720能夠提高全腦缺血再灌過(guò)程中CaMKK表達(dá)水平，進(jìn)而激活A(yù)kt發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，CaMKK/Akt信號(hào)通路可能成為治療腦缺血的有效靶點(diǎn)，而S1P受體激活后如何啟動(dòng)CaMKK/Akt信號(hào)通路，其機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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