鄭慕陽 陳海斌 梁業(yè)斌

糖尿病(diabetes mellitus，DM)實驗室分型診斷主要依靠胰島素及C-肽(C-P)釋放試驗，1型DM表現(xiàn)為胰島B細胞破壞導(dǎo)致胰島素絕對缺乏，2型DM則表現(xiàn)為胰島素抵抗為主伴胰島素分泌不足，或胰島素分泌不足為主伴或不伴有胰島素抵抗[1]。在日常工作中經(jīng)常會遇到不同程度的溶血標(biāo)本[2]，鑒于臨床對DM患者診斷、治療、監(jiān)測及預(yù)后判斷的需要，準(zhǔn)確了解標(biāo)本溶血對胰島素及C-肽測定的干擾尤為必要。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

采用德國Roche公司的E601全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套的胰島素及C-肽檢測試劑盒。

1.2 不同程度溶血標(biāo)本的制備

為了使胰島素和C-肽達到一定的測定濃度，抽取體檢者餐后1 h靜脈血液，一針兩管，分別注入帶分離膠的促凝試管。其中一管經(jīng)37 ℃水浴30 min后以4000 r/min、離心半徑為17.5 cm進行離心10 min，作為非溶血標(biāo)本；另一管放置-20 ℃冰箱保存2 h后取出融化，以4000 r/min、離心半徑17.5 cm進行離心10 min，分離溶血血清。用SYSMEX XT-1800i全自動血液分析儀測量血紅蛋白(Hb)質(zhì)量濃度，然后將溶血血清與非溶血血清按不同比例混合，得到血紅蛋白(Hb)質(zhì)量濃度為10 g/L、5 g/L、2.5 g/L、1.2 g/L 5、0.625 g/L的溶血標(biāo)本。

1.3 測量方法

室溫(20 ℃)環(huán)境下分為4個時間段(0、30 min、60 min、120 min)，分別測定溶血和非溶血標(biāo)本的胰島素及C-肽濃度。

1.4 溶血或時間因素對測定干擾的評價方法

按下式評價溶血或時間因素對測定結(jié)果的影響：

式中：|F|：溶血或時間因素引起的誤差；X：溶血標(biāo)本或放置一定時間后待測物濃度；X0非溶血血清待測物濃度。若|F|＞0.10，表示溶血干擾客觀存在，如|F|＜0.10，表示溶血干擾輕微，可以忽略不計[3]。

2 結(jié)果

標(biāo)本溶血可使胰島素濃度降低，溶血程度越大、標(biāo)本放置時間越長，胰島素濃度下降越明顯，胰島素濃度測定與標(biāo)本溶血程度及放置時間呈負相關(guān)；標(biāo)本溶血對電化學(xué)發(fā)光免疫法測定血C-肽無干擾。結(jié)果見表1、表2。

表1 不同時間段不同程度溶血標(biāo)本的胰島素濃度(uIU/ml)

表2 不同時間段不同程度溶血標(biāo)本的C-肽濃度(pmol/ml)

3 討論

胰島素由胰島B細胞合成和分泌，其分子量約為6000，由α、β2條肽鏈構(gòu)成的一種多肽，是人體內(nèi)惟一降低血糖的激素。它能增加細胞膜對葡萄糖、氨基酸及鉀離子通透性，促進葡萄糖的利用。胰島素分泌主要受血中葡萄糖濃度的調(diào)節(jié)，當(dāng)血中葡萄糖濃度升高，可刺激胰島素的分泌。C-肽由31個氨基酸殘基組成，胰島素在胰島B細胞形成之前，先在細胞內(nèi)合成胰島素原，并進而分解成等分子的C-肽和胰島素[4]。理論上血清中的C-肽和胰島素成一定比例關(guān)系，但C-肽不被肝臟破壞，在外周血中其分子濃度比胰島素高約5倍，半衰期約為胰島素的2倍多，并且藥用胰島素中不含C-肽，外源性抗體均不影響C-肽的測定。因此，對于接受胰島素治療的患者測定C-肽更能精確地判斷胰島B細胞的合成與釋放胰島素的功能水平[5]。

目前，測定胰島素和C-肽的主要方法有放射免疫分析(RIA)、時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)、酶免疫分析(EIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)以及電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECLIA)。由于RIA法報告時間長、結(jié)果不穩(wěn)定并且存在同位素污染的問題，已趨于淘汰；酶免疫分析法雖然克服了放射免疫分析中放射性污染的弊端，具有設(shè)備簡單，操作安全等優(yōu)點，但這種依靠比色法或偏振光法的檢測技術(shù)存在酶不穩(wěn)定、光度測量范圍窄、靈敏度不高、難以定量、易造成漏診和假陽性等不足，受到了應(yīng)用上的限制；時間分辨熒光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析及電化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有靈敏度高、特異性強、所用試劑具有良好的穩(wěn)定性、檢測范圍較寬、儀器能實現(xiàn)自動化、不污染環(huán)境以及能消除常規(guī)熒光測定中的高背景等優(yōu)點，是非放射免疫分析中很有發(fā)展?jié)摿Φ姆治龇椒ā５醒芯勘砻?，不同的分析方法對溶血的抗干擾能力不同，采用競爭分析法的放射免疫分析較采用雙抗體夾心法的電化學(xué)發(fā)光免疫分析法在測定胰島素時對溶血的抗干擾能力更強[6-7]。

通常正常人及2型DM患者的胰島素及C-肽釋放曲線如圖1、圖2所示。即正常人血清胰島素和C-肽均是空腹最低，餐后1 h最高，2 h次之，3 h接近空腹水平，而DM患者則表現(xiàn)為逐步上升的趨勢，即：空腹低，1 h較高，2 h最高，3 h次高甚至最高[4]。魏子坤等[8]研究表明，在可疑人群中即使其糖耐量完全正常，但胰島素和C-肽分泌異常者，如果不進行胰島素和C-肽釋放試驗將會降低診斷的準(zhǔn)確性，加大漏診率。

圖1 INS釋放曲線

圖2 C-肽釋放曲線

4 結(jié)語

由于紅細胞中含有胰島素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE)是一種過氧化物水解酶，能夠高效、特異地降解胰島素，被認(rèn)為是在細胞水平降解胰島素最主要的酶，隨著紅細胞的破壞，其內(nèi)存的IDE釋放進入血清，能導(dǎo)致溶血標(biāo)本胰島素濃度降低。本實驗顯示，標(biāo)本溶血對電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定C-肽無干擾；溶血標(biāo)本的胰島素測定結(jié)果與溶血程度及放置時間呈負相關(guān)[9-10]。在測定胰島素釋放試驗時，任何時間段的標(biāo)本溶血均可對釋放曲線的高低和走向產(chǎn)生影響，例如空腹階段標(biāo)本溶血造成的胰島素降低可能會被誤診成1型DM，正常人1 h階段標(biāo)本溶血造成的胰島素降低有可能誤診成2型DM等等，從而給臨床醫(yī)師的診斷和治療帶來困惑。因此，檢驗師做胰島素測定時要絕對避免溶血，在臨床中遇到不可避免的溶血標(biāo)本時應(yīng)在報告單上注明。臨床醫(yī)師面對胰島素釋放曲線和C-肽釋放曲線不相符情況下有必要與實驗室溝通以排除標(biāo)本因素的干擾。子能出版社,1991:190.

[6]沈云峰,胡遠貴.溶血對電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定胰島素的干擾[J].檢驗醫(yī)學(xué),2007,22(3):359-360.

[7]Cheyenne D,LetaiUerur A,Trivin F,et a1.Effect of hemolysis on the concentration of insulin in serum determined by RIA and IRMA[J].Clin Chem,1998,44(2):354-356.

[8]魏子坤,楊小麗,田竹芳.OGTT、IRT和CPRT聯(lián)檢在DM2診治中的價值[J].放射免疫學(xué)雜志,2006,19(1):11-13.

[9]Sapin R,Ongagna JC,Gasser F,et a1.Insulin measurements in haemolysed serum:influence of insulinase inhibltors[J].Clin Chim Acta,1998,274(1):111-117.

[10]Sapin R.Interference of hemolysis and hemoglobin：example of insulin assay[J].Ann Biol Clin,2001,59(1):113-114.