劉燕燕，尤良順，錢(qián)文斌，童 茵

(1.鄭州市中心醫(yī)院血液科，河南 鄭州 450007;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科，浙江 杭州 310003)

Bcr-Abl 融合基因產(chǎn)生于9 號(hào)和22 號(hào)染色體易位(Ph1 染色體)，這是慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的特征性分子標(biāo)志;該現(xiàn)象也發(fā)生于30%的急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)［1］。Bcr-Abl 融合蛋白能持續(xù)激活酪氨酸激酶及其多種下游信號(hào)分子，如STATs、AKT、ERK 等［2］，以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［3］;此外，它還參與介導(dǎo)了CML 對(duì)多種傳統(tǒng)化療藥物的耐受［4］，這可能是CML 急性變的主要原因。酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼(IM)是初診CML 患者的一線(xiàn)治療藥［5］，該藥能誘導(dǎo)CML 急性變和Ph1 陽(yáng)性ALL患者獲得完全緩解;但是有部分患者由于基因擴(kuò)增或者位點(diǎn)突變對(duì)IM 耐藥［7］。為此，研究者正在探索IM 與其他藥物聯(lián)合治療的策略。一些體外研究表明，IM 與Flavopiridol、MAPK抑制劑及組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑等聯(lián)用均展現(xiàn)出了協(xié)同作用［7-9］。

HDAC 抑制劑是一組能夠抑制組蛋白去乙?；富钚?，使靶蛋白恢復(fù)乙?；男》肿右种苿?，它通過(guò)減弱DNA 與組蛋白之間的相互作用，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，調(diào)控特定基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤目的［10-11］。有研究表明，HDAC 抑制劑可以下調(diào)Bcr-Abl mRNA 的表達(dá)，通過(guò)抑制HDAC6 促進(jìn)Bcr-Abl 的降解［12］。

本研究旨在探究HDAC 抑制劑SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)是否能夠增強(qiáng)IM 的抗CML 作用，以及對(duì)細(xì)胞凋亡和Bcr-Abl信號(hào)通路分子的影響，試圖尋找協(xié)同作用的潛在機(jī)制，為其聯(lián)合治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SAHA 購(gòu)自天津彬馨博奧科技有限公司，IM 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，二者均用DMSO 溶解并配置成1 mg/ml 儲(chǔ)存液，-20℃冰箱保存。CML 細(xì)胞株K562 由中科院上海細(xì)胞庫(kù)引進(jìn)，由本所常規(guī)保存。RPMI 1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和Hoechst 染料為美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品;Annexin V/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biouniquer 公司;Western-blot 抗體:內(nèi)參照β-Actin 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，PARP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcr-Abl、p-Bcr-Abl、STAT5、p-STAT5、JAK2、乙?；M蛋白H3(Ac-histone H3)和Mcl-1 單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell-Signaling 公司;熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司。

1.2 MTT 比色法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用取狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞，以3×104/ml 接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔200μl，分別加入10、20、40、80 nmol/L 的IM 和(或)0.25、0.5、1、2μmol/L 的SAHA，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，培養(yǎng)72 h 后加5 mg/ml 的MTT 工作液20μl 于各孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，250 g/min 離心5 min，吸棄上清后每孔加入200μl DMSO 震蕩，使底部藍(lán)紫色甲臜沉淀充分溶解后在酶標(biāo)儀570 nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度值(A)。抑制率(%)=(1 -實(shí)驗(yàn)組平均A 值)/對(duì)照組平均A 值×100%。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值為最終結(jié)果。

1.3 Hoechst 染色法觀察凋亡小體 K562 細(xì)胞經(jīng)過(guò)80 nmol/L 的IM 和(或)2μmol/L 的SAHA 處理24 h 后收集細(xì)胞，PBS 溶液洗滌3次后將細(xì)胞涂至防脫載玻片上，4%多聚甲醛固定30 min，0.5% Trixton-100 的PBS 溶液透化30 min，滴加Hoechst 工作液，避光常溫孵育20 min，水平搖床上用PBS 洗滌3次后于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 Annexin V/PI 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡 收集經(jīng)藥物聯(lián)合處理24 h 的K562 細(xì)胞，用預(yù)冷PBS 洗滌3次，棄上清，重懸于500μl 1×結(jié)合緩沖液中，按照Annexin V/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法操作，加入5μl 的Annexin V-FITC混勻后，再加入5μl Propidium Iodide 混勻，避光、室溫反應(yīng)10 min 后立刻用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)，CellQuest 1.2 分析軟件分析結(jié)果。

1.5 Western blot 方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 收集經(jīng)相應(yīng)藥物處理24 h 的K562 細(xì)胞，用預(yù)冷PBS 洗滌3次，棄上清，根據(jù)細(xì)胞團(tuán)塊的大小加1×細(xì)胞裂解液60～150μl，置冰上30 min，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理(160 W，持續(xù)5 s，間隔5 s，循環(huán)5次)，4℃、12 000 g/min 離心5 min，取上清液，用BCA 法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。取50μg蛋白行SDS-PAGE 分離蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入1∶1 000稀釋的相應(yīng)抗體，4℃過(guò)夜，用含0.05% Tween20 的TBS(TBST)洗3次，加入1∶5 000稀釋的二抗室溫水平搖床2 h，TBST 洗滌3次，加入ECL 工作液顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。計(jì)量資料用表示，多組均數(shù)間比較采用One way ANOVA，兩組均數(shù)間比較用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAHA 聯(lián)合IM 對(duì)K562 細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用 MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示，單獨(dú)用IM(10～80 nmol/L)或SAHA(0.25～2.0μmol/L)處理K562 細(xì)胞72 h 后能夠抑制其增殖，抑制率分別為(96.9±1.2)%、(90.1±5.0)%、(83.2±1.3)%、(58.7±3.3)% (F=54.14，P＜0.001)和(99.2±0.2)%、(96.2±2.4)%、(70.8±3.5)%、(36.0±2.4)%，呈劑量依賴(lài)性(F=433.8，P＜0.001)。聯(lián)合處理組在IM(20～80 nmol/L)、SAHA(0.5～2.0μmol/L)的濃度范圍內(nèi)與單藥組相比，抑制K562 細(xì)胞增殖作用顯著增強(qiáng)(P＜0.05);經(jīng)過(guò)CalcuSyn 軟件計(jì)算，其聯(lián)合指數(shù)(CI)＜1，證明SAHA 聯(lián)合IM 對(duì)K562 細(xì)胞有協(xié)同殺傷作用(圖1)。

圖1 SAHA 聯(lián)合IM 對(duì)K562 細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用Fig.1 SAHA and imatinib have a synergistic growth inhibitory effect on K562 cells

2.2 SAHA 增強(qiáng)IM 誘導(dǎo)的K562 細(xì)胞的凋亡為研究SAHA 和IM 對(duì)K562 細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡情況，本研究采用Annexin V/PI 染色、FACS檢測(cè)凋亡，結(jié)果顯示，SAHA(2μmol/L)、IM(80 nmol/L)單獨(dú)處理組以及兩藥聯(lián)合處理組的早期凋亡率分別為(51.43±3.75)%、(3.82±1.19)% 和(64.47±2.87)%，與 對(duì) 照組(3.28±1.23)% 比，單獨(dú)應(yīng)用IM 不能誘導(dǎo)K562 細(xì)胞凋亡(P ＞0.05)，單用SAHA 能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P＜0.01)，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡明顯增加(P＜0.05)。運(yùn)用Hoechst 染色法從形態(tài)學(xué)上檢測(cè)凋亡小體(圖2A)，結(jié)果顯示與FACS 分析結(jié)果一致。Caspase 通路激活是凋亡事件的核心機(jī)制。用80 nmol/L 的IM 和(或)2μmol/L 的SAHA 處理K562 細(xì)胞24 h 后收集蛋白，并行Western blot 檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖2B)，IM單獨(dú)處理組的凋亡相關(guān)蛋白PARP、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9 未見(jiàn)明顯的激活，SAHA單獨(dú)處理組的上述蛋白均有激活，而在兩者聯(lián)合處理組中，PARP、Caspase-3 和Caspase-8 的激活較單用SAHA組明顯增強(qiáng)，Caspase-9 的激活則未見(jiàn)明顯增強(qiáng)。通過(guò)測(cè)定Western blot 條帶的灰度值，與單藥組相比，聯(lián)合組Caspase 信號(hào)分子激活帶顯著高表達(dá)(P＜0.01，表1)，表明聯(lián)合處理組較單藥組更能增強(qiáng)對(duì)K562 細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡。

圖2 SAHA 增強(qiáng)IM 誘導(dǎo)的K562 細(xì)胞凋亡Fig.2 SAHA and imatinib cooperatively induce apoptosis in K562 cells

表1 各組Western blot 圖像灰度值比值分析Table 1 Comparison of gray values of Western blot images among different drug treatments(，n=3)

表1 各組Western blot 圖像灰度值比值分析Table 1 Comparison of gray values of Western blot images among different drug treatments(，n=3)

2.3 SAHA 和IM 對(duì)Bcr-Abl 及下游相關(guān)信號(hào)分子的影響 為了探索聯(lián)合用藥協(xié)同作用的機(jī)制，用80 nmol/L 的IM 和(或)2μmol/L 的SAHA 處理K562 細(xì)胞24 h 后提取總蛋白，Western blot 檢測(cè)Bcr-Abl 蛋白表達(dá)及其磷酸化水平(p-Bcr-Abl)和JAK2、p-STAT5 的表達(dá);同時(shí)還檢測(cè)了Mcl-1 的表達(dá)。結(jié)果顯示，低劑量IM 和SAHA 單獨(dú)對(duì)Bcr-Abl 影響較小，能輕微抑制p-Bcr-Abl;聯(lián)合處理后，Bcr-Abl 及其磷酸化水平顯著下調(diào)，對(duì)JAK2、p-STAT5 和Mcl-1 表達(dá)的抑制也有類(lèi)似的作用。此外，聯(lián)合用藥還能提高K562 細(xì)胞組蛋白乙酰化(H3)的水平(圖3)。通過(guò)灰度值比值分析，與單藥組相比，聯(lián)合組蛋白改變更為顯著(P＜0.01，表2)。

表2 各組Western blot 圖像灰度值比值分析Table 2 Comparison of gray values of Western blot images among different drug treatments(，n=3)

表2 各組Western blot 圖像灰度值比值分析Table 2 Comparison of gray values of Western blot images among different drug treatments(，n=3)

圖3 SAHA 聯(lián)合IM 對(duì)Ac-histone H3、Bcr-Abl及下游相關(guān)信號(hào)分子的影響Fig.3 Effects of SAHA and imatinib on Achistone H3、Bcr-Abl signaling in K562 cells

3 討論

IM 治療CML 慢性期患者，多數(shù)能獲得完全細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)(CGCR)，甚至完全分子生物學(xué)反應(yīng)(CMR);但仍有患者能檢測(cè)到Bcr-Abl，提示IM 不能清除白血病干細(xì)胞。IM 治療CML 晚期患者5年CGCR 只有57%，急變期患者細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)率只有6%～18%［13］。本研究結(jié)果顯示，低劑量IM 和SAHA 聯(lián)合能顯著抑制 K562 細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Western blot 結(jié)果顯示，聯(lián)合處理組中PARP、Caspase-3、Caspase-8 的激活較單用SAHA組明顯增強(qiáng)，提示聯(lián)合用藥激活外源性Caspase 途徑。與文獻(xiàn)報(bào)道HDAC 抑制劑激活外源性凋亡途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡結(jié)果一致［14］。更為重要的是，聯(lián)合用藥能抑制Bcr-Abl 蛋白表達(dá)，對(duì)磷酸化Bcr-Abl 的抑制更為明顯。本研究結(jié)果提示，IM 聯(lián)合SAHA 可能是治療對(duì)IM 反應(yīng)不佳的患者的一種新的治療策略，如晚期慢性期、加速期和急變期患者。

Bcr-Abl 的持續(xù)活化是IM 耐藥的主要機(jī)制之一，其與下述信號(hào)途徑異常激活有關(guān):①RAS/MAPK 激活;②STAT 磷酸化水平增高導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平增加;③PI3K/AKT 激活使得細(xì)胞凋亡減少［13，15］。本研究發(fā)現(xiàn)，IM 和SAHA 聯(lián)合處理K562 細(xì)胞能抑制JAK2 蛋白表達(dá)，下調(diào)磷酸化STAT5，這提示聯(lián)合用藥抑制了JAK2/STAT5 信號(hào)通路，可能是其抑制Bcr-Abl 及其磷酸化水平的作用機(jī)制。此外，IM 和SAHA 聯(lián)合也顯著下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1。Inoue 等［16］報(bào)道下調(diào)Mcl-1 能增強(qiáng)HDAC 抑制劑介導(dǎo)的髓系白血病細(xì)胞凋亡。最近研究證明，Mcl-1 是Bcr-Abl的靶基因，抑制Bcr-Abl 能下調(diào)Mcl-1［17］。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥時(shí)Bcr-Abl 及其磷酸化水平明顯下調(diào)，Mcl-1 的表達(dá)也明顯抑制，細(xì)胞凋亡增加，這也證明Mcl-1 是Bcr-Abl 的靶基因;其下調(diào)導(dǎo)致K562 細(xì)胞凋亡增加。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明IM 和SAHA 單獨(dú)應(yīng)用以劑量依賴(lài)性方式抑制K562 細(xì)胞株生長(zhǎng)，兩藥聯(lián)合使用在體外低劑量時(shí)能顯著協(xié)同殺傷K562 細(xì)胞，使細(xì)胞凋亡增加;聯(lián)合用藥能協(xié)同抑制Bcr-Abl 及其磷酸化水平，抑制JAK2/STAT5信號(hào)途徑，下調(diào)下游靶基因Mcl-1。本研究結(jié)果提示IM 聯(lián)合SAHA 可能是逆轉(zhuǎn)耐藥，對(duì)IM 反應(yīng)不佳的患者具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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