楊 莉，阮文靜，陳恩國(guó)，應(yīng)可凈

(1.浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院，浙江 杭州 310020;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310005)

肺癌在美國(guó)是癌癥患者死亡的頭號(hào)殺手［1］。近二十年來(lái)，隨著我國(guó)人口的老齡化以及人類(lèi)生活環(huán)境的污染與破壞，肺癌總體發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì);盡管肺癌的治療手段在不斷發(fā)展，但其5年生存率僅為15%［2］，這主要是臨床上大多肺癌患者確診時(shí)已屬晚期。有研究證實(shí)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌低生存率的主要原因［3］。那么，如何早期發(fā)現(xiàn)肺癌尤其是隱匿性肺癌，這對(duì)改善肺癌患者的生存率至關(guān)重要。

癌胚抗原(CEA)在肺腺癌、大細(xì)胞肺癌及肺鱗癌中表達(dá)均較高［4-6］，但是，其在其他惡性腫瘤(如結(jié)直腸癌)中也表現(xiàn)為異常升高;因此，該指標(biāo)較難成為肺癌敏感且特異的生物標(biāo)志物。

PET(正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像)和CT(電子計(jì)算機(jī)X 射線斷層掃描技術(shù))相結(jié)合的技術(shù)——PET/CT，對(duì)肺癌的診斷有較大的幫助，但是對(duì)于小于1 cm 的病灶診斷價(jià)值非常有限，而且該技術(shù)檢查費(fèi)用昂貴，具有一定的假陽(yáng)性。故而，目前在肺癌早期的診斷臨床操作中亟需尋找一個(gè)較為敏感和特異的診斷指標(biāo)。

NKX2-1(NKX homeobox-1 gene，NKX 同源框-1 基因)是NKX2 基因家族的含有同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)于人類(lèi)胚胎肺和成年肺中，以維持肺的正常發(fā)育及功能。有研究認(rèn)為，NKX2-1 可能是肺癌的一個(gè)驅(qū)動(dòng)核心［9-10］，是肺腺癌特異性的生物指標(biāo)。臨床研究認(rèn)為，NKX2-1 可作為判斷肺腺癌的組織來(lái)源［11］，以及肺源性惡性間皮瘤的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)［12］。然而，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)肺癌患者NKX2-1 表達(dá)的標(biāo)本，主要通過(guò)手術(shù)切除或活檢取到的腫瘤組織，應(yīng)用免疫組化方法進(jìn)行定性檢測(cè)，組織標(biāo)本均需在繁瑣的有創(chuàng)操作后得到。若能從外周血中直接測(cè)得NKX2-1 并發(fā)現(xiàn)它與肺癌的特異關(guān)系，不僅可以簡(jiǎn)化測(cè)定NKX2-1 的方法，還能為臨床診斷肺癌提供一種較為準(zhǔn)確和具有特異性的指標(biāo)。為此，本研究對(duì)61 例初次就診以肺部腫塊為特征的原發(fā)性肺癌進(jìn)行了血清NKX2-1 和CEA 蛋白的檢測(cè)，以探討NKX2-1 在肺癌中的臨床價(jià)值。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 肺癌組 在2009年5月至2010年12月期間，收集浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院呼吸內(nèi)科以肺部腫塊初次就診的肺癌患者，而且患者未進(jìn)行任何化療、放療、手術(shù)及分子靶向等治療，同時(shí)符合以下條件:①患者無(wú)甲狀腺疾病(經(jīng)甲狀腺超聲及甲狀腺功能證實(shí));②臨床無(wú)中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及體征;③無(wú)嚴(yán)重的其他心肺疾病及胃腸道系統(tǒng)腫瘤;④肺部腫塊均在氣管鏡下或CT 引導(dǎo)下穿刺取活檢組織，經(jīng)病理證實(shí)診斷為原發(fā)性肺癌?；颊呓?jīng)臨床系列評(píng)估后，根據(jù)2010年NCCN 非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)臨床實(shí)踐指南和2010年ESMO 小細(xì)胞肺癌(SCLC)臨床實(shí)踐指南進(jìn)行肺癌分期。此期間共收集肺部腫塊患者的血清共70 份，經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí):原發(fā)性肺癌患者61 人(肺癌組)，其中非小細(xì)胞肺癌52 例(肺腺癌32 例，肺鱗癌17 例，肺腺鱗癌2 例，非小細(xì)胞癌未分型1例)，小細(xì)胞肺癌8 例，未確診具體肺癌病理類(lèi)型1 人;轉(zhuǎn)移性肺癌1 例，炎性病變及良性腫塊4 例，血樣溶血4 例。

1.2 正常對(duì)照組 收集與肺癌組同一時(shí)期進(jìn)行健康體檢者為正常對(duì)照組。要求無(wú)肺部疾患，無(wú)甲狀腺疾病(經(jīng)甲狀腺超聲及甲狀腺功能證實(shí))，臨床未出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征，無(wú)嚴(yán)重的其他心肺系統(tǒng)疾病及胃腸道系統(tǒng)腫瘤。正常對(duì)照組收集血樣共49 份。

1.3 研究方法 采集研究對(duì)象血清(采集血液時(shí)不加抗凝劑)，立即離心1 500 r/min×15 min，取上清液，-80℃保存、備用。

1.3.1 酶聯(lián)免疫法定量檢測(cè)血清NKX2-1 蛋白表達(dá) 檢測(cè)前將血樣室溫下放置至完全溶解，根據(jù)試劑盒(上海藍(lán)基公司)步驟說(shuō)明進(jìn)行樣本處理，再使用BioTek 公司Synergy H4 酶標(biāo)儀，測(cè)定血清中NKX2-1 蛋白的表達(dá)含量(敏感度為0.01 ng/ml)。

1.3.2 電化學(xué)免疫發(fā)光法定量檢測(cè)血清CEA蛋白表達(dá) 采集血清方法同前，血清CEA 蛋白表達(dá)正常值為0～5 ng/ml，＞5 ng/ml 為異常。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用One-way ANOVA 檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，Kappa 檢驗(yàn)及ROC進(jìn)行診斷準(zhǔn)確性分析;P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者與正常人血清NKX2-1 蛋白表達(dá)的比較 肺癌組血清NKX2-1 蛋白含量為(1.4206±0.1257)ng/ml，高于正常對(duì)照組(0.7646±0.0734)ng/ml，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。

2.2 肺腺癌患者與肺鱗癌患者血清NKX2-1蛋白表達(dá)的比較 在NSCLC 中，肺腺癌組血清NKX2-1 蛋白含量為(1.3248±0.2900)ng/ml，肺鱗癌組為(1.4740±0.1634)ng/ml;兩組比較差異未見(jiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.3 肺癌患者不同分期血清NKX2-1 蛋白表達(dá)的比較 在NSCLC 中，Ⅰ期為(1.7672±0.5770)ng/ml，Ⅱ期為(0.9932±0.1393)ng/ml，Ⅲ期為(1.2397±0.2576)ng/ml，Ⅳ期為(1.4354±0.1882)ng/ml;經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)肺癌的分期與血清NKX2-1 的表達(dá)有關(guān)(P ＞0.05);但從結(jié)果看，Ⅰ期肺癌患者血清NKX2-1 的水平已經(jīng)發(fā)生了變化。

2.4 血清NKX2-1 蛋白進(jìn)行ROC 分析(圖1)曲線下面積(Az)為0.859，與Az 0.5 相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

圖1 血清NKX2-1 蛋白診斷肺癌的ROC 分析曲線Fig.1 ROC analysis curve of serum NKX2-1 protein in diagnosing lung cancer

2.5 肺癌患者血清CEA 和NKX2-1 蛋白表達(dá)的比較

2.5.1 CEA 在原發(fā)性肺癌患者中CEA 診斷靈敏度為42.6%，特異度為98.1%(表1)。其中，NSCLC 患者CEA 異常升高比例為42.3%，SCLC 患者CEA 升高比例為50.0%。

2.5.2 NKX2-1 為提出正常人血清中NKX2-1 的參考范圍，本研究先通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析確定正常對(duì)照組及肺癌組血清NKX2-1 蛋白定量有顯著性差異，再對(duì)110 例已測(cè)得血清NKX2-1 蛋白數(shù)值進(jìn)行ROC 分析(圖1)及Youdern 指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，得到最佳診斷分界點(diǎn)(cutoff point)對(duì)應(yīng)的NKX2-1 蛋白量——1.0148 ng/ml，以此為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)得到NKX2-1 在原發(fā)性肺癌患者中診斷靈敏度為70.5%，特異度為88.9%(表1)。其中，NSCLC 患者異常升高比例為69.2%，SCLC 異常升高比例為87.5%。

2.5.3 NKX2-1 和CEA 結(jié)合分析 NKX2-1 結(jié)合CEA 分析原發(fā)性肺癌患者的診斷靈敏度為83.6%(表1)。其中，NSCLC 患者異常升高比例為82.7%，SCLC 異常升高比例為100%。

表1 NKX2-1 和CEA 在原發(fā)性肺癌診斷中的價(jià)值Table 1 The value of NKX2-1 and CEA in the diagnosis of primary lung cancer［%(陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù))］

血清NKX2-1 對(duì)原發(fā)性肺癌診斷與病理診斷總符合率為79.1%，血清CEA 為68.7%，結(jié)合兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行平行試驗(yàn)分析診斷率為85.2%;Kappa 值NKX2-1 為0.586，CEA 為0.396，NKX2-1 +CEA 為0.704。

3 討論

本研究結(jié)果顯示:①原發(fā)性肺癌患者血清NKX2-1 蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，定量分析顯示，肺癌組NKX2-1 蛋白是正常對(duì)照組的2 倍;ROC 分析及Kappa 統(tǒng)計(jì)提示，血清NKX2-1 蛋白定量水平是診斷肺癌的又一個(gè)較好的敏感且有效的指標(biāo)。②血清NKX2-1 蛋白在原發(fā)性肺癌中異常升高的陽(yáng)性率明顯高于CEA，而且前者的靈敏度、總符合率及Kappa 值均高于后者(P＜0.01)，但特異度較CEA 低。③若將血清NKX2-1 蛋白結(jié)合CEA 蛋白共同評(píng)估原發(fā)性肺癌，則其診斷的靈敏度、特異度、總符合率及Kappa 值分別為83.6%、87.0%、85.2%和0.704%，大大提高了與病理診斷相一致的水平，增加了原發(fā)性肺癌診斷的靈敏度和特異度，明顯減少了原發(fā)性肺癌的漏診率。

同時(shí)，本組資料顯示:①Ⅰ期肺癌NKX2-1的水平已經(jīng)發(fā)生變化，這對(duì)早期肺癌的判斷和發(fā)現(xiàn)可能有一定的價(jià)值。②NKX2-1 在腺癌組及小細(xì)胞肺癌組的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)87.5%，這與NKX2-1 在肺癌病理組織類(lèi)型中的表達(dá)結(jié)果相似(肺腺癌和小細(xì)胞肺癌NKX2-1 高表達(dá))［9，14-15］。另外，在此階段收集的樣本中，有4例非腫瘤患者，其中2 例為良性腫瘤(血清NKX2-1 蛋白的表達(dá)水平是正常對(duì)照組的3 倍和5 倍，是肺癌組的1.5 倍和2.5 倍)，2 例為肺部炎癥(血清NKX2-1 的表達(dá)水平比正常人群NKX2-1 的均值低)，提示血清中NKX2-1 蛋白的表達(dá)，不僅能用于早期肺癌的診斷，還能通過(guò)定量檢測(cè)NKX2-1 蛋白的表達(dá)水平以鑒別肺部不明原因腫塊的性質(zhì)(良性腫瘤、炎癥抑或肺癌)。

血清NKX2-1 蛋白在原發(fā)性肺癌中的臨床價(jià)值，值得我們更多的探索和驗(yàn)證。目前已完成收集及檢測(cè)的病例數(shù)有限，循證依據(jù)尚欠力度，在今后的工作中，還需要我們積累大樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行深入的研究，以期發(fā)現(xiàn)NKX2-1 在肺癌中的重要臨床價(jià)值，并得到更為準(zhǔn)確的結(jié)論以指導(dǎo)臨床的早期診斷和治療工作。

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