李 輝，冉 珂，唐正國，李雙鳳，常業(yè)恬

(1.中南大學湘雅二醫(yī)院麻醉科，湖南 長沙 410011;2.長沙市第三醫(yī)院麻醉科，湖南 長沙 410015)

硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后發(fā)現(xiàn)的第三個內(nèi)源性氣體信號分子，其參與機體許多生理和病理過程的調(diào)節(jié)。有研究表明，H2S 預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用［1］，但是其保護機制目前尚未完全闡明。S-腺苷蛋氨酸合成酶(SAM-s)是一種促進高半胱氨酸合成的重要酶，而高半胱氨酸在體內(nèi)經(jīng)過氧化后可產(chǎn)生大量氧自由基，導致細胞損傷［2］。H2S 預處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用是否與SAM-s 有關目前未見報道。為此，本研究擬通過研究H2S 預處理對大鼠心肌SAM-s 表達的影響，以探討其對心肌缺血再灌注損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康成年SD 雄性大鼠40 只，體重300～350 g，由湖南斯萊景達實驗動物有限公司提供。

1.2 儀器設備 H150 呼吸機、MD100-2 電子分析天平、內(nèi)切式勻漿機、721 分光光度儀、恒溫水浴箱、恒溫震蕩器等系國產(chǎn)儀器;H-7500透射電子顯微鏡、CH30 光學顯微鏡、攝影系統(tǒng)、全自動生化分析儀、5415R 型高速低溫臺式離心機、壓力換能器、電轉印裝置、計算機圖像分析系統(tǒng)系美國等國外公司產(chǎn)品。

1.3 試劑 硫氫化鈉(NaHS)、5-羥葵酸(5-HD)、伊文思藍、氯化硝基四氮唑藍、戊巴比妥鈉均為美國Sigma 公司產(chǎn)品，丙烯酰胺、無水乙醇、異丙醇、氯仿、二甲苯等均為國產(chǎn)試劑，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒均為南京建成生物工程研究所。

1.4 方法

1.4.1 缺血再灌注模型的制備 參考文獻［3-4］方法制備大鼠缺血再灌注模型，大鼠經(jīng)腹腔推注3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 麻醉，多導聯(lián)心電監(jiān)測。氣管插管，動物呼吸機控制呼吸，潮氣量8～10 ml/kg，頻率70次/min。在心尖搏動最明顯處之上一肋間隙開胸，切開心包，確認左冠圓錐支，在圓錐支之后用7-0 絲線結扎左冠前降支，立即可見左室前壁紫紺充血，心率減慢，血壓一過性下降，心電圖監(jiān)測S-T 段明顯抬高，確認阻斷成功。

1.4.2 動物分組 將40 只健康成年S-D 雄性大鼠隨機分成4組:假手術組(S組)、缺血再灌注組(IR組)、硫化氫組(H組)和硫化氫預處理+線粒體KATP 通道阻斷劑(5-羥葵酸，5-HD)組(D組)，每組10 只。S組僅開胸并分離冠狀動脈左前降支，不阻斷血流150 min;IR組行冠狀動脈左前降支阻斷30 min，再灌注120 min;H組靜脈注射NaHS 0.05 mg/kg，給藥后24 h 同IR組處理，D組缺血前15 min 靜脈注射5-HD 5 mg/kg，其它同H組處理。

1.5 心肌梗死面積的測量 實驗結束立刻重新阻斷左冠前降支并從尾靜脈注入1%伊文思藍2 ml，充分染色后取出心臟。分離左心室(包括室間隔)，濾紙吸干后將心臟放在-20 ℃冰箱10 min 后取出，切片，每片厚約1～2 mm。血供正常心肌呈藍染，缺血區(qū)心肌呈紫紅或蒼白，缺血心肌與正常心肌比值即為缺血危險區(qū)。將心肌置于37℃10%TTC 中水浴15 min，氧化還原反應后存活心肌呈藍色，梗死心肌呈灰色，危險區(qū)心肌呈紅色。4%甲醛固定24 h 后，每個心臟切片進行數(shù)碼照相，留取左心室稱重。左心室，缺血區(qū)(非藍色區(qū))和心肌梗死區(qū)(灰色區(qū))面積用Image-Pro Plus 5.0 軟件計算。心肌缺血區(qū)范圍用心肌缺血區(qū)重量占左心室重量百分比表示。心肌梗死范圍用心肌梗死區(qū)重量占心肌缺血區(qū)重量百分比表示。

1.6 心肌SAM-s 的測定 采用免疫印跡分析，在再灌注120 min 結束即刻，取左心室前壁心肌組織提取蛋白，并于-70℃儲存?zhèn)溆?。?00μg 心肌蛋白于12.5%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，分離的心肌蛋白隨后通過電轉印裝置轉印至PVDF 膜，室溫下在封閉液中作用3 h，再加入SAM-s 抗體，4℃孵育過夜，用TTBS 緩沖液沖洗15 min×4次后，加入二抗羊抗鼠IgG，室溫搖動孵育1h，再用TTBS 緩沖液充分沖洗，最后進行增強化學發(fā)光反應。結果用GIS-700D 型凝膠圖像系統(tǒng)進行掃描分析，記錄平均光密度值表示心肌SAM-s 表達。

1.7 生化指標測定 于再灌注結束即刻抽取動脈血2 ml，以4 500 r/min 分離血清，-20℃保存待測。采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸鹽法分別測定血清丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)。

1.8 統(tǒng)計學處理 將各組測得的值進行統(tǒng)計學處理，采用SPSS 13.0 軟件分析。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差()表示，進行完全隨機設計的方差分析，多組均數(shù)的比較采用LSD法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心肌梗死面積變化 除S組外，各組心肌缺血面積無明顯差異(P ＞0.05);與IR組比，H組心梗面積降低(P＜0.05)，D組無明顯差異(P ＞0.05，表1 和圖1)。

表1 各組大鼠心肌缺血面積及心梗面積的比較Table 1 The changes of infarct area and area at risk in each group(，n=7)

表1 各組大鼠心肌缺血面積及心梗面積的比較Table 1 The changes of infarct area and area at risk in each group(，n=7)

與IR組比，* P＜0.05.

圖1 大鼠左室心肌Evan's Blue 與TTC 染色后切片F(xiàn)ig.1 The slice of myocardium of the rat ventriculus sinister under staining of Evan's Blueand TTC

2.2 各組MDA 含量和SOD 活性的變化 與IR組比較，H組的SOD 活性升高，MDA 含量降低(P＜0.05)，而D組上述指標與IR組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，表2)。與IR組比較，D組的SOD 活性和MDA 含量變化不大，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，表2)。

表2 各組大鼠血漿MDA 含量及SOD 活性的變化Table 2 Changes of plasma levels of MDA and SOD of each groups (，n=10)

表2 各組大鼠血漿MDA 含量及SOD 活性的變化Table 2 Changes of plasma levels of MDA and SOD of each groups (，n=10)

與IR組比較，* P＜0.05.

2.3 各組大鼠心肌SAM-s 表達 心肌SAM-s光密度值S組為(49.1±7.3)，表達水平較低;與S組比較，IR組(179.6±10.4)表達上升(P＜0.05);H組為(108.6±14.1)，表達低于IR組(P＜0.05)，D組為(188.5±12.8)，表達與IR組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠心肌SAM-s 蛋白表達Fig.2 Western blot products of SAM-s expression of each group

3 討論

硫化氫(H2S)作為一種內(nèi)源性氣體信號分子，在體內(nèi)有兩種存在形式:1/3 以氣體形式，2/3 可能以硫氫化鈉(NaHS)形式存在。NaHS在體內(nèi)可解離成鈉離子和硫氫根離子，后者與體內(nèi)氫離子結合生成H2S，H2S 與NaHS 形成一種動態(tài)平衡。NaHS 溶液與內(nèi)源性H2S 的體內(nèi)的存在方式相似，而且NaHS 的濃度便于精確定量H2S 含量，而H2S 氣體飽和的液體則不便于精確定量H2S 的濃度，因此NaHS 溶液是較理想的外源性H2S 供體。Elrod 等［5］在研究H2S預處理對心肌損傷的保護機制中，發(fā)現(xiàn)從5～50μg/kg 不同劑量的NaHS 之中，50μg/kg的保護作用最強，因此，本研究采用IR 前24 h給予NaHS 50μg/kg 預處理的方案。

心肌梗塞面積是國際公認的評價心肌缺血損傷的金指標，TTC 染色法是公認的檢測早期心肌細胞不可逆損傷的最可靠而靈敏的方法［6-7］。在本研究中，IR組和H組的缺血面積無顯著性差異，表明LAD 阻斷效果肯定，而且各組LAD 阻斷部位基本一致。與IR組比，H組心梗面積明顯降低，提示H2S 預處理能減輕心肌損傷程度。

SAM-s 合成酶是促進高半胱氨酸合成的重要酶，SAM-s 在甲基轉移酶的作用下生成S-腺苷高半胱氨酸，后者進一步脫去腺苷，生成高半胱氨酸。文獻報道，高半胱氨酸是糖尿病微血管病變的獨立危險因素［2］，在糖尿病性心肌病大鼠心肌組織中的高表達是誘發(fā)加重糖尿病性心肌病發(fā)病的重要因素，這與細胞內(nèi)高半胱氨酸經(jīng)氧化產(chǎn)生大量氧自由基，引起血管內(nèi)皮損傷和功能障礙有關。本研究結果顯示，各個實驗組心肌SAM-s 表達增高，提示缺血再灌注作為一種病理生理刺激因素，導致心肌細胞的蛋白質(zhì)表達發(fā)生變化。另一方面，心肌缺血再灌注期間產(chǎn)生大量氧自由基是引起缺血再灌注損傷的的主要因素，其對心肌的損傷主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化作用，導致心肌細胞的損傷［8-9］。Yang 等［10］證實，心肌缺血再灌注期間有大量氧自由基產(chǎn)生，而體內(nèi)最重要的脂質(zhì)過氧化作用的代謝產(chǎn)物是MDA，故測定MDA 能較好地反映組織脂質(zhì)過氧化程度，間接反映出細胞損傷程度［11］，SOD 是體內(nèi)清除自由基的一種特異酶，如果其活性降低，可導致氧自由基堆積，因此其活性變化可反映體內(nèi)抗氧化功能情況。本研究結果顯示，H2S 預處理組SAM-s 表達和MDA 含量降低，SOD 活性升高，提示H2S 預處理對心肌的保護作用可能是通過抑制S-腺苷蛋氨酸合成酶的表達，進一步抑制高半胱氨酸在心肌內(nèi)的高表達，從而減少氧自由基的產(chǎn)生以及對心肌造成的脂質(zhì)過氧化反應。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，H2S 預處理+線粒體KATP 通道阻斷劑組的心梗死面積、MDA 含量、SOD 活性以及心肌SAM-s 表達等指標均無明顯變化，提示線粒體KATP通道介導了H2S 預處理對缺血再灌注心肌的保護作用。

總之，本研究表明，H2S 預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能是通過抑制心肌SAM-s 表達，減少氧自由基的生成，增強心肌抗氧化能力有關。

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