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晚期非小細(xì)胞肺癌患者體液標(biāo)本表皮生長因子受體突變基因檢測的進(jìn)展

2012-01-22 12:02操樂杰
中華肺部疾病雜志(電子版) 2012年4期
關(guān)鍵詞:胸腔積液標(biāo)本

王 灃 操樂杰

盡管肺癌的診斷、分期、治療日趨規(guī)范化,但由于缺乏有效的早期篩查制度和方法,加之傳統(tǒng)化療的療效出現(xiàn)平臺期,導(dǎo)致肺癌患者總體預(yù)后依然很差,5年生存率僅為16%[1]。隨著分子腫瘤學(xué)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物,其突變參與了腫瘤的生長、侵襲等過程。針對這一靶點(diǎn)的藥物酪氨酸激酶抑制劑(如吉非替尼、??颂婺岬?開創(chuàng)了肺癌分子靶向治療的先河。臨床實(shí)踐證明非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者間存在分子靶向藥物療效上的差異,這種差異主要體現(xiàn)在肺癌患者體細(xì)胞EGFR是否存在分子突變。而發(fā)生分子突變的患者療效極佳,可見突變檢測對選擇合適人群進(jìn)行靶向治療具有重大意義。過去對EGFR突變檢測多是基于組織標(biāo)本,但晚期肺癌患者組織標(biāo)本往往很難獲得,因此找到一種理想的標(biāo)本,建立合適的檢測方法進(jìn)行EGFR突變檢測是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)?,F(xiàn)就NSCLC患者極易反復(fù)獲取的體液標(biāo)本中的EGFR基因突變檢測及意義加以綜述。

一、EGFR的常用檢測方法

直接測序法被公認(rèn)為是EGFR基因檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”,該法能確切判斷突變堿基及突變位置,而且可以發(fā)現(xiàn)新的突變基因。但被測標(biāo)本DNA純度要求不能低于30%突變才能檢出,因而,往往需要選用微切割腫瘤組織標(biāo)本[2]。為了滿足臨床的廣泛需求,國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用不同EGFR檢測方法對晚期NSCLC患者的體液標(biāo)本進(jìn)行過嘗試,目前報(bào)道較多的三種是蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變法(SARMS法)、突變體富集法PCR、變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC法)。

1.SARMS法:該方法引入了應(yīng)用于等位基因鑒定的Scorpions蝎形結(jié)構(gòu)特異性探針。該探針包含一個(gè)與3',端共價(jià)相連的PCR引物,僅僅能識別突變序列,而不識別正常序列,附加錯(cuò)配突變設(shè)計(jì)在3',端引物序列中,從而實(shí)現(xiàn)特異性的擴(kuò)增。Scorpions探針與ARMS技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用比常見的熒光探針PCR技術(shù)更為先進(jìn),其可檢測單個(gè)突變,提高了方法的特異性及檢測結(jié)果的可靠性。國內(nèi)廈門艾德公司在基于實(shí)時(shí)PCR平臺的基礎(chǔ)上結(jié)合了特異引物和雙環(huán)探針兩種技術(shù),建立了ADx特異擴(kuò)增技術(shù)。該試劑盒與國際公認(rèn)EGFR檢測試劑盒在檢測靈敏度及檢測結(jié)果的一致性上已經(jīng)被國內(nèi)多家醫(yī)院所驗(yàn)證,有望使SARMS法對EGFR突變的檢測實(shí)驗(yàn)過程更加快捷,費(fèi)用更經(jīng)濟(jì)。但SARMS法也有局限,它是針對已知突變基因進(jìn)行相應(yīng)探針的設(shè)計(jì),因此無法檢測未知突變基因。

2.突變體富集PCR法:該方法基本原理是利用ras基因家族某個(gè)密碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),在兩次擴(kuò)增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化野生型的EGFR基因片斷,野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增,而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增,從而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的富集,再使用PCR放大和凝膠電泳技術(shù),根據(jù)產(chǎn)物的大小進(jìn)行突變的判斷。該方法同樣是基于PCR技術(shù),因此實(shí)驗(yàn)過程中避免污染尤其重要,目前該方法主要用于19、21外顯子的基因突變檢測,不能檢測約占全部突變10%左右的其他EGFR基因的突變。

3.DHPLC法:變性高效液相色譜技術(shù)是近年來國內(nèi)外興起的一種用于分析核苷酸片段的技術(shù)平臺。該系統(tǒng)可在非變性、部分變性、完全變性三種條件下運(yùn)行,其中部分變性條件適用于EGFR基因突變的檢測,能分離、識別野生型及突變型DNA雙鏈。DHPLC法在EGFR突變基因檢測峰型中易于判讀,且有利于發(fā)現(xiàn)未知突變基因,具有快速、高通量、操作簡單、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn),該方法不足的是只能檢測有無突變,而不能區(qū)分突變類型。

二、不同標(biāo)本中EGFR突變基因檢測在臨床的應(yīng)用

1.外周血標(biāo)本中EGFR突變基因的檢測

早在1977年,Leon等[3]已發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清、血漿中循環(huán)DNA含量明顯高于健康人群。其來源可能與原發(fā)腫瘤的釋放、外周循環(huán)中腫瘤微轉(zhuǎn)移灶的釋放、腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死釋放有關(guān)[4]。采用PCR探針技術(shù)和熒光技術(shù),對肺癌患者外周血標(biāo)本進(jìn)行EGFR突變基因檢測,在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)盡可能的將血和腫瘤組織進(jìn)行匹配或者對同一類型標(biāo)本采用不同方法檢測,并通過觀察分子靶向治療效果以驗(yàn)證循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTC)及外周血游離DNA(cell free DNA,cfDNA)中EGFR突變基因檢測結(jié)果的可靠性。

(1)外周血游離DNA(cfDNA):指外周血細(xì)胞外DNA,存在于血清、血漿中的游離DNA都可用來檢測EGFR突變基因。二者的優(yōu)劣性采用血漿似乎要比血清更好,這可能與血清中的混合成分有關(guān),有研究稱隨著炎性細(xì)胞數(shù)量的增加,血清循環(huán)DNA比例增加,而血漿并非如此[5]。血標(biāo)本具有獲取方便的優(yōu)點(diǎn),但容易被污染。相關(guān)研究表明cfDNA被污染量與標(biāo)本采集后血清、血漿分離時(shí)間成正相關(guān)[6]。此外cfDNA穩(wěn)定性較差,血清、血漿cfDNA標(biāo)本在處理前應(yīng)保存于-20℃或是更低的環(huán)境,且濃度波動范圍很大(10~1200 ng/ml),片段短(-180 bp),由腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死產(chǎn)生的cfDNA在總cfDNA中的比例不等(3% ~93%),不同腫瘤類型cfDNA的比例亦不一致,并且與腫瘤的分期、分級、大小及位置有關(guān)。鑒于以上特點(diǎn),cfDNA用于基因檢測對方法的選擇要求很高,直接測序法存在著很大的局限性。Kimura等[7]研究發(fā)現(xiàn)cfDNA在血標(biāo)本中敏感度僅為66%,特異度為71%,這可能會導(dǎo)致部分EGFR突變陽性的患者因?yàn)闄z測方法選擇不當(dāng)而失去谷氨酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑治療的機(jī)會。較敏感檢測方法SARMS法在cfDNA的應(yīng)用報(bào)道較多,2007年Kimura報(bào)道采用SARMS法檢測cfDNA樣本中EGFR的敏感性為85%,特異性94%,腫瘤組織和血標(biāo)本突變檢測結(jié)果一致率高達(dá)92.9%[8]。在用血清標(biāo)本中檢測EGFR陽性的患者給予吉非替尼治療獲得的中位 PFS明顯長于 EGFR陰性的患者(174 d vs 58 d,P=0.044)。在此之后Maheswaran報(bào)道12例肺癌患者游離血漿標(biāo)本中有4例EGFR陽性[9]。Liu等[10]對18例血漿標(biāo)本中用SARMS法突變檢出率為80%。以上研究所示的突變檢出率波動幅度很大,其原因可能與入組的條件等有關(guān),其中腫瘤的分期也影響著EGFR突變檢測結(jié)果。Bai等[11]對230例ⅢB期-Ⅳ期NSCLC腫瘤組織和cfDNA標(biāo)本使用DHPLC法進(jìn)行了19、21號外顯子EGFR突變分析,結(jié)果顯示cfDNA和相匹配的腫瘤組織突變一致性達(dá)79.7%。此外Yung等[12]對微數(shù)字PCR方法進(jìn)行過嘗試,該法能檢測單個(gè)突變DNA分子,并可精確地區(qū)別突變和野生型序列,對血漿標(biāo)本中EGFR突變檢測的敏感性和特異性能達(dá)到92%和100%,較SARMS法更適合EGFR突變檢測。

目前突變體富集PCR法應(yīng)用較廣泛。惠福海等[13]應(yīng)用突變體富集PCR法檢測EGFR基因21號染色體突變情況,在23例腫瘤組織中有8例突變陽性,其中采用cfDNA檢測中7例得到一致結(jié)果(87.5%)。突變體富集PCR法實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物的富集,He等[14]在此基礎(chǔ)上聯(lián)合采用直接測序法,在血漿cfDNA中發(fā)現(xiàn)19、21外顯子EGFR突變檢出率達(dá)49.3%,與配對的腫瘤組織檢測結(jié)果一致性為94.4%。cfDNA中EGFR突變陽性較野生型患者在應(yīng)用吉非替尼二線治療后PFS有很大差異(7.609個(gè)月vs 2.877個(gè)月,P=0.002)。Jiang等[15]證實(shí)對cfDNA采用突變體富集PCR檢測EGFR突變結(jié)果和組織標(biāo)本中檢測結(jié)果的一致性可達(dá)93.1%,且cfDNA中突變體富集法的敏感性和特異性分別為77.8% 和100%,相反非富集PCR技術(shù)的敏感性和特異性則要遜色很多。

(2)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC):外周血成份復(fù)雜,為了降低檢測結(jié)果的假陽性,產(chǎn)品的純化十分必要。通常每毫升血中CTC數(shù)量僅為1~10個(gè),這較混合存在的白細(xì)胞及紅細(xì)胞數(shù)量少很多,導(dǎo)致檢測難度較大。相對較成熟的CTC濃縮檢測技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種較好的方法。

CTC檢測在乳腺癌、結(jié)腸癌等癌癥患者中涉及頗廣。Maheswaran等[9]基于微流體技術(shù)設(shè)計(jì)了一個(gè)分離、純化芯片,針對上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)的抗體,分離出NSCLC患者CTC,并對分離后的CTC采用SARMS法進(jìn)行EGFR基因突變檢測,發(fā)現(xiàn)其靈敏度達(dá)92%。CTC標(biāo)本在EGFR突變檢出靈敏度方面較cfDNA標(biāo)本高,但其腫瘤細(xì)胞的純化技術(shù)復(fù)雜,目前難以推廣,其優(yōu)越性有待進(jìn)一步證實(shí)。

采用NSCLC患者外周血標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測具有可行性,cfDNA標(biāo)本較CTC標(biāo)本在目前的應(yīng)用更為廣泛。血標(biāo)本EGFR基因突變檢測結(jié)果對指導(dǎo)臨床治療很有價(jià)值。鑒于標(biāo)本自身的特點(diǎn),對檢測方法而言敏感性較高的SARMS法及突變體富集PCR法更受青睞,尤其是采用試劑盒的SARMS法在操作上更有明顯優(yōu)越性。

2.胸腔積液標(biāo)本中EGFR突變基因的檢測

惡性胸腔積液在各類型肺癌中很常見,尤其在肺腺癌中更為多見,其形成往往與腫瘤的直接侵犯或是胸膜轉(zhuǎn)移有關(guān),合并積液的患者往往提示腫瘤晚期不能接受外科手術(shù)[16]。研究發(fā)現(xiàn)胸腔積液脫落細(xì)胞是檢測致癌基因點(diǎn)突變很有價(jià)值的標(biāo)本,很多學(xué)者對此類標(biāo)本用作EGFR基因突變檢測進(jìn)行了探討。

(1)胸腔積液DNA片段游離細(xì)胞(cell-free pleural fluid):惡性胸腔積液中往往存在著片段DNA,但其濃度很低,Kimura等[17]收集了43例ⅢB-Ⅳ期NSCLC患者的胸腔積液游離細(xì)胞標(biāo)本,應(yīng)用直接測序法對EGFR18-21號外顯子進(jìn)行了突變分析,突變檢出率為25.6%,其中女性、非吸煙人群檢出率較高。該組中的27例患者給予吉非替尼靶向治療后病灶達(dá)到PR、SD的各有7例,檢測結(jié)果均為突變陽性。而突變陰性的患者均為疾病持續(xù)進(jìn)展者。Wu等[18]采用直接測序法在該類標(biāo)本中的突變檢出率達(dá)高68.4%,這一差異可能是所檢測的范圍和入組的條件不同所致。

何臣等[19]對30例NSCLC患者胸腔積液游離DNA進(jìn)行了EGFR19及21外顯子突變分析,并比較了酶切富集PCR法及非酶切富集PCR法對胸腔積液EGFR基因突變檢出率的差異。結(jié)果證實(shí)酶切富集PCR法的檢測靈敏性顯著高于非酶切富集PCR法(50.0%vs 23.3%),這一結(jié)果與Zhang等[20]報(bào)道的檢出率相當(dāng)(50.0%vs 31.0%)。酶切富集PCR法對胸腔積液DNA游離細(xì)胞標(biāo)本EGFR突變基因檢測是一種較直接測序法更為靈敏、簡便可行、能解決問題且費(fèi)用低廉的方法,具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

(2)胸腔積液細(xì)胞(pleural effusion cells):由于肺癌胸腔積液標(biāo)本包含有突變成分、正常細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及間皮細(xì)胞等混合成分,導(dǎo)致DNA純度不夠,入組的患者檢出突變率多較低。Kimura等[21]收集了24例NSCLC患者的胸腔積液,采用胸腔積液細(xì)胞,同時(shí)應(yīng)用直接測序法和敏感性較高的SARMS法對EGFR18-21號外顯子突變基因進(jìn)行檢測。共檢測出8例突變陽性患者,其中有3例在兩種方法中出現(xiàn)一致的結(jié)果,而另外5例僅在敏感性高的SARMS法檢測中出現(xiàn)陽性突變。值得關(guān)注的是在入組的患者中有7例得到吉非替尼治療,其中4例達(dá)到PR,直接測序法檢測到陽性的患者只有2例達(dá)到PR。在此研究中直接測序法突變檢出率僅為12.5%,而SARMS法突變檢出率為33.3%。這預(yù)示惡性胸腔液是一種可選的被檢測標(biāo)本類型,SARMS法靈敏度明顯高于直接測序法。值得注意的是Zhang等[20]對胸腔積液無細(xì)胞懸液和脫落細(xì)胞沉渣兩種標(biāo)本EGFR基因突變檢測結(jié)果進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)二者在敏感性高的突變體富集PCR方法中檢測結(jié)果具有一致性。

在異質(zhì)性高的胸腔積液標(biāo)本中,敏感性較高的SARMS法和突變體富集PCR法檢測擁有較大的優(yōu)勢。胸腔積液標(biāo)本的留取、儲藏較為簡便,和石蠟組織標(biāo)本比較更為新鮮,而且該類標(biāo)本EGFR陽性檢測結(jié)果有指導(dǎo)臨床靶向治療的價(jià)值。

3.其他:支氣管鏡檢查、痰液檢查是臨床診斷肺癌的重要手段,但面臨的困難依然是不能獲得足夠的組織以滿足病理評估后的基因分析。Hiroyuki等[22]收集了61例肺癌患者的支氣管內(nèi)膜上皮細(xì)胞襯液標(biāo)本,應(yīng)用PNA-LNA鉗夾法進(jìn)行了EGFR突變檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測敏感率達(dá)58.3%。該方法簡單、安全,且未直接接觸瘤體,在進(jìn)行活檢、灌洗、刷片前只需用一微量樣本采集探針進(jìn)行上皮細(xì)胞襯液采集即可,避免了血液雜合成分的影響。表明氣管鏡采集微量標(biāo)本是另外一種檢測腫瘤基因改變的補(bǔ)充方法。痰液標(biāo)本含有呼吸道上皮脫落細(xì)胞,是容易獲得的生物學(xué)標(biāo)本。痰細(xì)胞學(xué)已用于肺癌的診斷分析,但腫瘤相關(guān)細(xì)胞DNA或游離DNA量相對于炎性細(xì)胞DNA的量較少,因而目前尚未見到以該類標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測的相關(guān)文獻(xiàn)。

對NSCLC患者接受TKI治療前進(jìn)行EGFR基因突變基因的篩選,無論采用哪種標(biāo)本類型,應(yīng)保證足夠多的腫瘤細(xì)胞,盡量剔除非腫瘤細(xì)胞。突變檢測的方法及細(xì)胞純化的技術(shù)尚有待進(jìn)一步改進(jìn),體液標(biāo)本與組織標(biāo)本檢測結(jié)果的一致性及體液標(biāo)本突變陽性患者靶向獲益的情況報(bào)道不一,尚需更多的研究進(jìn)一步證實(shí)。對于不能獲得組織標(biāo)本的NSCLC患者應(yīng)用外周血、胸腔積液等體液標(biāo)本進(jìn)行EGFR突變基因檢測將為患者TKI治療提供有價(jià)值的依據(jù)。

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