吳冠楠 宋 勇

Rho蛋白在細(xì)胞內(nèi)起到分子開關(guān)的作用，Rho/ROCK信號通路在細(xì)胞的粘附、變形、遷移、增殖、凋亡等多種行為方面起到重要調(diào)控作用。Rho蛋白的異常表達(dá)或激活被發(fā)現(xiàn)與肺癌細(xì)胞生物學(xué)特征和患者預(yù)后等有顯著相關(guān)性，并可能成為潛在治療靶點。現(xiàn)就Rho/ROCK信號通路在肺癌中的作用及其潛在治療作用做一綜述。

一、Rho相關(guān)信號通路

1．Rho蛋白與Rho激酶和mDia1:Rho蛋白或Rho GTP酶(Rho GTPase)是Ras超家族的組成之一，為小分子量(相對分子量20×103～30×103)GTP結(jié)合蛋白，目前已從哺乳動物中分離出20種Rho蛋白家族成員，分別為 Rho(RhoA、RhoB 和 RhoC)、Rac(Rac1、Rac2、Rac3和 RhoG)、Cdc42(Cdc42Hs、G25K 和 TC10)、Rnd(RhoE/Rnd3、Rnd1/Rho6 和 Rnd2/Rho7)、RhoD(RhoD 和 Rif)、RhoH/TTF、Wrch(Wrch-1和 Wrch-2)和 RhoBTB(RhoBTB1 和 RhoBTB2)亞型，其中以 Rho、Rac、Cdc42研究較為集中［1］。Rho蛋白在細(xì)胞內(nèi)以兩種狀態(tài)存在，即與GTP結(jié)合狀態(tài)(活化型)和與GDP結(jié)合狀態(tài)(失活型)。與GTP結(jié)合的Rho蛋白主要定位于細(xì)胞膜，具有磷酸酶活性，并可以和效應(yīng)分子相互作用，從而啟動下游信號通路;與GDP結(jié)合的Rho蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，為失活狀態(tài)。調(diào)節(jié)Rho蛋白失活與活化狀態(tài)轉(zhuǎn)換的分子主要有以下兩類:鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子(guanosine nucleotide exchange factors，GEFs)、GTP 酶激活蛋白(GTPase activating proteins，GAPs)。GEFs經(jīng)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被激活后，催化Rho．GDP轉(zhuǎn)化為Rho．GTP，從而使Rho蛋白被激活;GAPs則參與激活Rho．GTP本身的GTP酶活性，導(dǎo)致Rho．GTP水解為 Rho．GDP，從而使 Rho蛋白失活［2］。GEFs和GAPs具有相對特異性，如NET1的底物僅為RhoA，而GEF-H1的底物則包括RhoA、RhoB和RhoC，F(xiàn)ilGAP的底物僅為Rac1，而p190-RhoGAP的底物則包括RhoA、RhoB和RhoC［3］。此外鳥苷酸游離抑制因子(guanosine nucleotide dissociation inhibitor，GDIs)也參與細(xì)胞內(nèi)Rho蛋白活性的調(diào)節(jié)，GDIs可以和細(xì)胞內(nèi)處于失活狀態(tài)的Rho蛋白結(jié)合，增加Rho蛋白的穩(wěn)定性［4］。

Rho激酶(Rho associated kinases，ROCKs)是Rho蛋白的主要效應(yīng)分子，可被磷酸化而激活，它為一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，相對分子量約為160×103，ROCK分子結(jié)構(gòu)主要分為三部分:N端的激酶結(jié)構(gòu)域、中間的螺旋結(jié)構(gòu)域和C端的PH結(jié)構(gòu)域，其中Rho蛋白通過作用于C端的雙螺旋部分而使ROCK激活，ROCK有兩種異構(gòu)體:ROCK1(ROCKβ)和ROCK2(ROCKα)，二者均分布廣泛，但ROCK1在非神經(jīng)組織中含量相對更高，而ROCK2在肌肉和大腦中含量相對更高［5］。

mDia1(mammalian diaphanous1)是黑腹果蠅翅膀中diaphanous蛋白的同源物，屬于成蛋白(formin)相關(guān)蛋白家族，它是Rho蛋白除ROCK外的另一效應(yīng)分子［6］。

2．Rho相關(guān)信號通路的生物學(xué)功能:Rho蛋白通過活化與失活狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)下游信號通路的開啟與關(guān)閉，從而起到分子開關(guān)的作用。Rho/ROCK信號通路、Rho/mDia1信號通路和其他Rho相關(guān)信號通路在細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，可以通過促進(jìn)肌球蛋白輕鏈磷酸化、肌動蛋白聚集、調(diào)節(jié)微管等促進(jìn)細(xì)胞收縮、聚集［5-6］。Machacek等［7］發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移行過程中，在突觸形成前，RhoA、Cdc42和Rac1在突觸形成部位均被激活，其中以RhoA最先活化，而后于稍遠(yuǎn)離突出前端的2 μm部位，Cdc42和Rac1也被激活。三者活化程度與突觸生長速度呈正比，RhoA的活化啟動了突觸的形成，而Cdc42和Rac1的活化則進(jìn)一步促進(jìn)突觸的擴(kuò)展。用血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)處理的內(nèi)皮細(xì)胞中，RhoA、Cdc42和Rac1迅速被激活，暗示Rho蛋白可能是血管內(nèi)皮生長因子受體(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)直接的下游分子之一。RhoA的活化可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，RhoA、Cdc42和Rac1的活化可以促進(jìn)血管基底膜的降解、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、移行以及毛細(xì)血管的形成，Rho蛋白在新生血管形成中發(fā)揮重要的作用［8］。多種信號周期調(diào)節(jié)蛋白均是Rho/ROCK信號通路下游分子，如細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白D3、細(xì)胞周期蛋白A、P21和P27等。RhoA、Cdc42和Rac1可調(diào)節(jié)其表達(dá)或活性，從而促進(jìn)細(xì)胞的G1/S期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞增殖［8-9］。上皮細(xì)胞極性是其重要的特性之一，細(xì)胞極性丟失與細(xì)胞遷移、浸潤和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等密切相關(guān)。Chartier等［10］研究發(fā)現(xiàn)，Rac1和PI3K的激活可以使上皮細(xì)胞丟失極性，抑制二者中的任意一個均可使該效應(yīng)顯著降低。

二、Rho與肺癌

目前，在多種腫瘤中均已發(fā)現(xiàn)Ras基因的突變。Rho雖然作為Ras超家族的一員，但其突變在腫瘤中并不多見，而Rho的異常表達(dá)和活化卻常見于多種腫瘤［11］。在肺癌組織或細(xì)胞系中，Rho的表達(dá)異常和激活已被多個研究所證實。Touge等［12］研究發(fā)現(xiàn)，RhoA在大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)，而在肺腺癌細(xì)胞系中表達(dá)相對較低，但RhoA在各種肺癌細(xì)胞系中均被顯著激活，尤其以小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系最為顯著。癌性錨蛋白重復(fù)序列(gann ankyrin repeats)蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤蛋白，Man等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在Ras突變的肺癌中，gankyrin表達(dá)量顯著增高，增高的gankyrin促進(jìn)RhoA與GDIs結(jié)合，從而使得游離狀態(tài)RhoA減少，抑制RhoA/ROCK/PTEN信號通路，從而導(dǎo)致Akt的持續(xù)活化，后者則是Ras突變誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤形成的關(guān)鍵。上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)可以抑制非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancers，NSCLC)細(xì)胞的增殖和浸潤，Asnaghi等［14］研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin抑制NSCLC細(xì)胞增殖作用主要是通過下調(diào)RhoA或Cdc42的表達(dá)。敲除RhoA或Cdc42基因后，NSCLC細(xì)胞增殖和浸潤能力均顯著下降。肺癌患者的預(yù)后與其分期密切相關(guān)，Chen等［15］發(fā)現(xiàn)，肺癌患者的癌組織中Cdc42呈過表達(dá)，而且Cdc42過表達(dá)與患者的高TNM分期和高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)性，抑制Cdc42的表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞系801D的遷移、浸潤等。K-Ras基因是重要的原癌基因，K-Ras基因突變在肺癌的發(fā)生中起到重要作用。Kissil等［16］研究發(fā)現(xiàn)Rac1在K-Ras突變誘導(dǎo)的肺癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Rac1敲除可導(dǎo)致K-Ras突變上皮細(xì)胞的增值能力大幅度下降。轉(zhuǎn)移是肺癌的一大特征，Ikoma等［17］研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中RhoC表達(dá)增加，過表達(dá)的RhoC并不影響肺癌細(xì)胞的生長和增值，但可顯著增加肺癌細(xì)胞的遷移和浸潤能力，并促進(jìn)其基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的合成和分泌，并增加MMP-2的活性。由此可見，部分起到“促癌”作用的Rho蛋白不僅在肺癌的發(fā)生中起到重要作用，更可能與肺癌細(xì)胞增值、遷移、浸潤、腫瘤血管形成、癌栓形成、EMT等相關(guān)，從而與肺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

與RhoA、Cdc42和Rac1等在肺癌中的“促癌”不同，RhoB具有潛在的“抑癌”作用。Mazieres等［18］研究發(fā)現(xiàn)，隨著肺癌浸潤性增高，RhoB在癌組織中的表達(dá)量大幅度下降，同時RhoB表達(dá)丟失與肺癌的高分期、高浸潤性、低分化、高增值指數(shù)等存在顯著相關(guān)性，而經(jīng)處理的RhoB過表達(dá)的A549細(xì)胞的增殖、生長等均顯著下降。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中RhoB的低表達(dá)或不表達(dá)主要是由組蛋白低乙酰化所引起，在應(yīng)用組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑處理后的肺癌細(xì)胞系中可見顯著的RhoB復(fù)表達(dá)［19］。而RhoB低表達(dá)可促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞的遷移和浸潤，其主要是通過激活A(yù)KT1并依賴于Rac1的激活，從而導(dǎo)致PI3K/AKT信號通路被激活［20］。Howe等［21］研究發(fā)現(xiàn)，RhoB在內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、出芽和毛細(xì)血管形成中發(fā)揮重要作用，其部分機(jī)制為抑制RhoA/ROCK信號通路。由此可見，RhoB表達(dá)丟失可能是肺癌細(xì)胞獲得浸潤性的特征之一，其作用機(jī)制可能和PI3K/AKT信號通路被激活有關(guān)，而且Rho蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能也發(fā)揮重要作用。

三、Rho相關(guān)藥物在肺癌治療中的潛在作用

法舒地爾(fasudil)為Rho激酶的抑制劑，具有廣泛的藥理作用。A549細(xì)胞是人肺腺癌上皮細(xì)胞系，Zhu等［22］研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾可以抑制A549細(xì)胞MMP-2和MMP-9的活性，并且下調(diào)RhoA和VEGF的表達(dá)，抑制A549細(xì)胞的增殖、移行和浸潤等生物學(xué)行為。NCI-H446細(xì)胞為人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，Yang等［23］研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾可以抑制NCI-H446細(xì)胞的MMP-2和MMP-9的活性，并促進(jìn)caspase3的活化和過氧化物酶增殖體活化受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)的降解，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。法舒地爾還可以抑制NCI-H446細(xì)胞的生長、增值、黏附、移行、浸潤等生物學(xué)行為。VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞移行是腫瘤血管形成和腫瘤血管轉(zhuǎn)移的重要部分。Yin等［24］研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾可以抑制人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞張力絲形成、黏著斑聚集及其酪氨酸激酶活性，從而抑制VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的移行、抗凋亡和內(nèi)皮細(xì)胞管道化作用，抑制腫瘤血管的形成。而且法舒地爾可以抑制VEGF誘導(dǎo)的肌球蛋白輕鏈磷酸化，從而影響腫瘤新生血管的功能。法舒地爾在體外實驗中對肺癌細(xì)胞和對新生血管的抑制作用已被證實，但其確切的分子機(jī)制尚未明確，而且目前尚缺乏令人信服的法舒地爾對肺癌治療作用的相關(guān)體內(nèi)試驗。但法舒地爾治療其他惡性腫瘤的動物試驗結(jié)果顯示，法舒地爾可以抑制惡性腫瘤在動物模型體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。Ying等［25］研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠肝癌腹膜播散模型中，法舒地爾可顯著減少腹膜癌結(jié)節(jié)數(shù)量和腹水的形成，在人纖維肉瘤肺轉(zhuǎn)移小鼠模型中，法舒地爾可顯著減少肺部轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。在原位乳腺癌細(xì)胞接種小鼠模型中，法舒地爾也可以顯著減少癌結(jié)節(jié)數(shù)量。但該研究同樣顯示出法舒地爾的抑制作用與結(jié)節(jié)大小成反比的趨勢，提示法舒地爾主要作用于腫瘤轉(zhuǎn)移的早期，其預(yù)防轉(zhuǎn)移的意義可能更大。

羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑(HMG-CoA reductase inhibitor)，即他汀類(statins)藥物，具有廣泛的藥理作用。他汀類藥物主要可通過抑制類異戊二烯的合成而影響Rho的膜定位，抑制Rho蛋白的活化，從而阻斷相關(guān)信號通路活化下游效應(yīng)分子［26］。Zhao等［27］研究發(fā)現(xiàn)。洛伐他汀(lovastatin)可抑制RhoA等Rho蛋白的活化，從而抑制EGFR二聚體的形成和AKT的活化，洛伐他汀和吉非替尼(gefitinib)在多種腫瘤細(xì)胞系中均表現(xiàn)出協(xié)同的細(xì)胞毒性作用，但對于三期NSCLC患者的臨床資料研究顯示，洛伐他汀并未增加厄洛替尼臨床療效，但洛伐他汀聯(lián)合厄洛替尼有改善預(yù)后的趨勢，二者生存曲線分離相對較明顯［27］。

四、小結(jié)

肺癌轉(zhuǎn)移是其導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一，Rho在細(xì)胞中的作用極其廣泛，且存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與調(diào)解細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮重要的作用，尤其在肺癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。目前法舒地爾、他汀類藥物是潛在的可用于肺癌輔助治療的藥物，法舒地爾對肺癌的治療作用主要集中于體外實驗，而對其主要作用機(jī)制、體內(nèi)試驗、臨床研究等尚有待進(jìn)一步研究。他汀類藥物的體外實驗同樣顯示其對細(xì)胞毒性的協(xié)同作用，但目前相關(guān)的回顧性臨床研究結(jié)果并不支持其作為三期NSCLC患者的輔助治療，相關(guān)研究中合用洛伐他汀的病例總數(shù)也過少，而且并非臨床隨機(jī)對照(randomized controlled trial，RCT)研究，目前尚需進(jìn)一步的、更大樣本量、患者臨床特征相對局限的RCT研究。

RhoA可以促進(jìn)EGFR形成二聚體，RhoB可以抑制AKT活化。RhoA、Rac1也可以促進(jìn)AKT活化。Rho與EGFR和AKT的相互作用也可能會成為肺癌治療，尤其是對EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor)耐藥患者治療的新的突破點。

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