陳德寶 萬汝根 樓永剛 王茂峰

(東陽市人民醫(yī)院,浙江 東陽 322100)

發(fā)作性睡病(narcolepsy)是一種終生性睡眠疾病,常于青春期前起病。典型特征為白天過度嗜睡、夜間睡眠紊亂以及病理性快速眼動睡眠(REM),還可并發(fā)猝倒、睡眠幻覺、耳鳴、憂慮、焦慮、記憶力減退等癥狀[1-4]。近年來國外已有關(guān)于發(fā)作性睡病與HLA抗原基因相關(guān)性的研究報道[5-7]。本研究用序列特異性引物的聚合酶鏈反應(PCR-SSP)對發(fā)作性睡病及健康人HLA-DRB1等位基因進行檢測,以了解特異性發(fā)作性睡病的遺傳易感基因。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年1月～2011年4月來本院就診的特異性發(fā)作性睡病組:中國漢族患者28例,均符合發(fā)作性睡病診斷標準:參照睡眠障礙國際分類(ICSD)[8-9],并結(jié)合發(fā)作性睡病的臨床特征:(1)患者有白天過度嗜睡或突然肌無力主述;(2)每天有頻繁小睡或突然進入睡眠狀態(tài);(3)多導睡眠圖(polisomnography,PSG)記錄:睡眠潛伏期小于10分鐘;快速眼動睡眠潛伏期小于20分鐘;多次睡眠潛伏期試驗(MSLT)中平均睡眠潛伏期小于5分鐘;兩次以上睡眠開始時REM發(fā)作。其中男22例,女6例;年齡12～41歲,平均 19歲。對照組:為與患者同地區(qū)、無血緣關(guān)系、無特異性發(fā)作性睡病發(fā)病史及無睡眠呼吸暫停綜合征的健康人群,共36例,兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 Taq DNA聚合酶(美國QIAGEN公司)、Qiagmp DNA Blood Mini Kit(美國QIAGEN公司)、HLA-DRB1基因分型試劑盒(德國BAG公司)。PCR自動擴增儀(GeneAmp 9700,ABI,USA)、微量凝膠電泳系統(tǒng)(Abgeme,英國)、紫外分光分析系統(tǒng)(MultiImageTM,Aipha Innotech Corporation)。

1.2.2 基因組DNA的制備 應用DNA提取試劑盒抽提外周血白細胞中的DNA。取5μL的DNA樣品,用紫外分光光度法檢測樣品的A值及純度,最后DNA調(diào)準為80μg/mL。

1.2.3 實驗方法 應用PCR-SSP(polymerase chain reaction/sequence primers)方法檢測HLA-DRB1位點的基因型。將含有DNA、Taq DNA聚合酶、PCRMix的混合液以每孔10μL的量加入HLA-DRB1基因分型板的24個含特異性引物的小孔。PCR擴增條件為96℃預變性120秒,63℃退火和延伸55秒,1個循環(huán);96℃變性10秒,63℃退火和延伸50秒,9個循環(huán);96℃變性10秒,59℃退火55秒,72℃延伸30秒,20個循環(huán)。

1.2.4 基因型的確定 以1%的瓊脂糖凝膠電泳,120V穩(wěn)壓12分鐘。紫外燈下觀察,根據(jù)PCR產(chǎn)物的有無及分子量大小對照HLA-DRB1基因分型格局表確定基因型別。

1.3 統(tǒng)計學處理 直接計數(shù)法計算基因頻率。基因頻率(%)=(實際檢出數(shù)/被檢人數(shù))×2。兩組間基因頻率的比較采用 χ2檢驗。P值均用Bonferroni法進行校正。

2 結(jié) 果

共檢出13種基因型。每例HLA-DRB1座位上有兩個等位基因,故統(tǒng)計分析了發(fā)作性睡病組中56個基因與正常對照組中72個基因。患者組DRB1*15基因頻率(51.8%)較正常對照組(16.7%)明顯增高,經(jīng)統(tǒng)計有顯著性差異(χ2=17.84,P＜0.01),患者組其它基因頻率與正常對照組比較無顯著性差異(P＞0.05),見表1。

表1 發(fā)作性睡病組與正常對照組HLA-DRB1基因分布

3 討 論

DRB1是HLAⅡ類基因主要的表達位點,最顯著的特征是具有明顯的多態(tài)性。DRB1是決定宿主免疫應答能力最重要的遺傳因素,其產(chǎn)物決定不同個體對抗原免疫應答的差異,并影響著病情進展[10-11]。本研究采用 PCR-SSP方法對HLADRB1等位基因進行了檢測,結(jié)果顯示HLA-DRB1*15在發(fā)作性睡病組及正常對照組中的基因頻率分別為51.8%和16.7%,經(jīng)統(tǒng)計學分析有顯著性差異(P＜0.01)。此結(jié)果進一步證實了HLA-DRB1*15為發(fā)作性睡病的易感基因,這與國外其他學者的研究一致[12]。肖毅等[13]研究了10例發(fā)作性睡病患者,結(jié)果顯示HLA-DRB1*1501為該疾病的易感基因,與國外其他學者的研究一致。HLA-DRB1*15可細分成多個等位基因,HLA-DRB1*1501是DRB1*15的最常見基因。

不同的HLAⅡ類基因產(chǎn)物參與遞呈不同的抗原肽,并誘發(fā)出特異性和強度不同的免疫應答。HLA-DRB1*15可能在免疫應答過程中起重要的調(diào)控作用,使T細胞激活,導致免疫反應增強,參與發(fā)作性睡病病變的形成。HLAⅡ類分子在自身反應性T細胞的成熟中以及T細胞活化和免疫識別中起重要作用。HLA具有高度多態(tài)性,不同的HLA分子因結(jié)構(gòu)上的差別,特別是抗原結(jié)合部位上某些氨基酸殘基的不同,在一定程度上決定了HLA分子對自身抗原的親和力,從而直接影響它們遞呈抗原肽并激活特異性T細胞的能力。據(jù)此推測,可能是這一類將自身抗原遞呈給抗原特異性T細胞的特殊HLA分子攜帶著發(fā)作性睡病的遺傳易感性,且可影響病情進展。

本組結(jié)果顯示HLA-DRB1*15基因為中國發(fā)作性睡病患者的易感基因,可以輔助該疾病的診斷。但發(fā)作性睡病在中國人群的發(fā)病率只有0.04%[14],要對發(fā)作性睡病患者作進一步的診斷和治療尚需更大的樣本量及更深層次的探索。

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