逄小紅 郭靜芹

(1.泰山醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，山東 泰安 271016； 2.泰山護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山東 泰安 271000)

缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是一種在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的核轉(zhuǎn)錄因子。 研究[1-2]證實(shí)，HIF-1α可調(diào)控包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vasular endothelial growth factor,VEGF)在內(nèi)的眾多促血管生長(zhǎng)因子的生成以及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)。S100A4是Ca2+結(jié)合蛋白S100家族的成員之一，可降低細(xì)胞間黏附能力、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)水解和重塑、增加腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力、促進(jìn)血管生成等，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[3-5]。作為腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的S100A4是否受HIF-1α調(diào)控，相關(guān)的報(bào)道很少。我們采用手術(shù)新鮮標(biāo)本在mRNA及蛋白質(zhì)水平檢測(cè)HIF-1α和S100A4在胃癌中的表達(dá)情況，分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系以及二者之間的相互聯(lián)系，旨在探討HIF-1α和S100A4在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 胃腺癌手術(shù)標(biāo)本45例，男25例，女20例，年齡29～65歲，中位年齡52歲。采集方法：同一患者胃癌組織及切端未被損毀正常組織均于術(shù)后半小時(shí)內(nèi)采集，新采標(biāo)本由乙二基焦磷酰胺處理，凍存管分裝，液氮運(yùn)送并立即凍存于-80℃冰箱待用。標(biāo)本性質(zhì)均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。

1.2方法

1.2.1主要試劑 Trizol購(gòu)于美國(guó)Gibco BRL 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本Takara公司，PCR試劑盒購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。小鼠抗人HIF-1α單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Lab Vision公司，兔抗人S100A4多克隆抗體購(gòu)于Neo Marker公司，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2.2RNA提取 按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)操作。測(cè)定RNA濃度及吸光度(A)值，A值在1.8～2.0之間，并經(jīng)1%甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳觀(guān)察RNA質(zhì)量以檢測(cè)其完整性。

1.2.3RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄。每20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系加入總RNA 1 μg，合成cDNA第1鏈，反應(yīng)條件為30℃ 10 min，42℃ 30 min，95℃ 5 min，5℃ 5 min。HIF-1α、S100A4和β-肌動(dòng)蛋白內(nèi)參照引物序列及退火溫度見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：94℃60 s，55℃ 50 s，72℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物直接在 1.5%瓊脂糖凝膠中(含溴化乙錠)電泳，紫外燈下觀(guān)察目的條帶，采用IBAS2.0Kontron真彩圖像分析儀對(duì)條帶灰度值進(jìn)行掃描分析。

表1 擴(kuò)增基因、引物、擴(kuò)增片段大小及退火溫度

1.2.4免疫組化染色和判斷標(biāo)準(zhǔn) 操作步驟按免疫組化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。以枸櫞酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，明膠甘油封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知的結(jié)腸癌陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。HIF-1α和S100A4均以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性。首先按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；然后按陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分：腫瘤細(xì)胞內(nèi)無(wú)陽(yáng)性染色者為0分，陽(yáng)性細(xì)胞率≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩者乘積≤2分為免疫組化反應(yīng)陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 癌組織和正常組織mRNA表達(dá)比較用Studentt檢驗(yàn)，癌組織和正常組織蛋白質(zhì)表達(dá)比較用χ2檢驗(yàn)。HIF-1α和S100A4相關(guān)性分析采用χ2關(guān)聯(lián)性分析。全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組織和切端正常胃黏膜組織HIF-1α和S100A4 mRNA表達(dá)情況 切端正常胃黏膜組織未見(jiàn)HIF-1α和 HIF-1α mRNA的表達(dá)。在胃癌組織中HIF-1α mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶位于168 bp位置，S100A4 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶位于 340 bp位置，β-肌動(dòng)蛋白mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶位于513 bp位置。擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)凝膠灰度掃描進(jìn)行定量分析，胃癌組織HIF-1α mRNA的相對(duì)含量為0.5207±0.0375，S100A4 mRNA的相對(duì)含量為0.6493±0.0300。

2.2胃癌組織和切端正常胃黏膜組織HIF-1α和S100A4 蛋白質(zhì)表達(dá)情況 HIF-1α蛋白在切端正常胃黏膜組織無(wú)表達(dá)，在胃癌組織胞核與胞質(zhì)均有表達(dá)，核強(qiáng)于胞質(zhì)(圖1)。胃癌組織中HIF-1α蛋白陽(yáng)性率為60%(27/45)。S100A4蛋白在正常胃黏膜中幾乎無(wú)表達(dá)，在胃癌組織中有中等強(qiáng)度的胞質(zhì)著色，偶見(jiàn)胞核著色，血管平滑肌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞也有著色(圖2)。S100A4在胃癌組織中的陽(yáng)性率為48.9%(22/45)。

圖1 HIF-1α蛋白在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)(SP×200)

圖2 S100A4蛋白在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)(SP×200)

2.3臨床病理關(guān)系研究

2.3.1HIF-1α和S100A4 mRNA與臨床病理關(guān)系 HIF-1α和S100A4 mRNA表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期有關(guān),其表達(dá)水平隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分期的升高而增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05，P﹤0.01)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)兩者mRNA與其他臨床病理因素有聯(lián)系(表2)。

2.3.2HIF-1α和S100A4蛋白與臨床病理關(guān)系 HIF-1α和S100A4蛋白表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度和臨床病理分期有關(guān)，其表達(dá)水平隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)層次的深入和臨床病理分期的升高而增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均﹤0.05)。HIF-1α和S100A4表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)(表3)。

表2 HIF-1α和S100A4 mRNA與胃癌臨床病理關(guān)系

表3 HIF-1α和S100A4蛋白與胃癌臨床病理關(guān)系

2.4胃癌組織中HIF-1α表達(dá)和S100A4表達(dá)的關(guān)系 對(duì)HIF-1α和S100A4 mRNA進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.971，P=0.000，兩者表達(dá)呈正相關(guān)。HIF-1α蛋白和S100A4蛋白表達(dá)亦呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.345，P=0.020，表4)。

表4 胃癌組織HIF-1α與S100A4蛋白表達(dá)的關(guān)系

3 討 論

HIF-1是由α和β亞基組成的異二聚體核轉(zhuǎn)錄因子，其中HIF-1α是HIF的調(diào)節(jié)亞基和功能亞基，決定HIF的活性。近年來(lái)的研究[6-8]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在人類(lèi)多種腫瘤中高表達(dá)，而且HIF-1α的高表達(dá)既是反映腫瘤組織缺氧的指標(biāo)，也是腫瘤預(yù)后不良的標(biāo)志，與腫瘤的臨床惡性進(jìn)程存在明顯正相關(guān)，而與治療敏感性、患者生存率存在負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白在切端正常胃黏膜組織無(wú)表達(dá)，在胃癌組織胞核與胞質(zhì)均有表達(dá)，且HIF-1α的表達(dá)水平隨腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度和臨床病理分期的升高而增高，說(shuō)明HIF-1α的表達(dá)與腫瘤的關(guān)系密切。HIF-1α高表達(dá)的原因，一方面考慮由于癌組織生長(zhǎng)過(guò)快，血供不足造成的缺氧狀態(tài)，使蛋白酶體介導(dǎo)的HIF-1α的降解途徑被阻斷所致。同時(shí)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的癌基因、轉(zhuǎn)錄共激活因子p300、NO等諸多物質(zhì)構(gòu)成的信號(hào)通路亦可刺激HIF-1α 的活化，增加HIF-1α mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平[9]。

S100A4蛋白與其它21個(gè)成員共同組成鈣離子結(jié)合蛋白S100家族，通過(guò)鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞增殖、分化，肌肉收縮，基因表達(dá)、分泌及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)諸多研究[3-5]表明，S100A4蛋白的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中S100A4的陽(yáng)性表達(dá)率為48.9%，在正常胃黏膜中幾乎無(wú)表達(dá)。S100A4的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度和臨床病理分期有關(guān)，即在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移組，在浸潤(rùn)侵及漿膜組顯著高于未侵及漿膜組，在臨床分期中，隨臨床分期的升高而明顯增加，即分期越晚，S100A4的陽(yáng)性率越高，提示S100A4蛋白參與胃癌的發(fā)生及發(fā)展，與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以用于評(píng)估病情。

本研究還發(fā)現(xiàn)胃癌組織中HIF-1α和S100A4 mRNA表達(dá)高于切端正常胃黏膜組織，HIF-1α和S100A4 mRNA表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期有關(guān),而與腫瘤浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)，這可能與HIF-1α和S100A4轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示, 胃癌組織中HIF-1α和S100A4的表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平均呈正相關(guān)關(guān)系, 表明二者在生化水平上存在一定的關(guān)聯(lián)，在功能上可能存在相互作用機(jī)制?；萚10]應(yīng)用低氧模擬劑氯化鈷處理胃癌細(xì)胞BGC823,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)氯化鈷處理后, 胃癌細(xì)胞S100A4 mRNA 及蛋白表達(dá)明顯增加,提示低氧模擬劑氯化鈷可促進(jìn)胃癌細(xì)胞BGC823 中S100A4 基因表達(dá)。Zhang R等[11]在隨后的研究中應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到S100A4基因的內(nèi)含子存在低氧反應(yīng)元件(hypoxia responsive element, HRE)，并且發(fā)現(xiàn)HIF-1可以與HRE結(jié)合,提示S100A4是低氧誘導(dǎo)基因,它的轉(zhuǎn)錄至少部分是通過(guò)HIF-1和HRE結(jié)合后激活的。因此推測(cè)HIF-1α和S100A4關(guān)系的機(jī)制可能為：隨著腫瘤的不斷生長(zhǎng)、體積增大，血供不足產(chǎn)生缺氧微環(huán)境，誘導(dǎo)HIF-1α過(guò)度表達(dá)。HIF-1α轉(zhuǎn)移入胞核后與HIF-1β形成異二聚體，與S100A4 HRE結(jié)合，啟動(dòng)S100A4的轉(zhuǎn)錄，使S100A4表達(dá)上調(diào)。

通過(guò)以上研究表明，HIF-1α與S100A4過(guò)表達(dá)可能是胃癌發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中的重要分子事件，與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，在一定程度上體現(xiàn)腫瘤的惡性潛能。因此，HIF-1α與S100A4可能作為腫瘤診斷和進(jìn)展的生物學(xué)指標(biāo)，成為基因治療以及免疫治療的靶點(diǎn)，具有重要的基礎(chǔ)和臨床意義。

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